ERITROVIRUS Y SUS APLICACIONES.

Un eritrovirus variante en relación al eritrovirus de tipo B19,

denominado eritrovirus de tipo V9, caracterizado por que presenta una divergencia genética < o igual al 6% con la secuencia SEC ID Nº:1, y por que su genoma se hibrida específicamente en condiciones rigurosas con una de las secuencias SEC ID Nº:45 a 80, 108 y 110 y por que dicho eritrovirus V9 no puede reconocerse molecularmente como un genoma del eritrovirus B19, ya que presenta una divergencia genética superior o igual al 10% sobre el conjunto del genoma en comparación con las secuencias del eritrovirus B19

La presente invención se refiere a secuencias nucleicas procedentes de un eritrovirus humano, a sus fragmentos así como a sus aplicaciones, como reactivo de diagnóstico y como agente inmunógeno.

Los estudios seroepidemiológicos muestran que la infección por parvovirus B19, recientemente renombrado eritrovirus B19, se ha extendido común y ampliamente en todo el mundo.

En Europa, la seroprevalencia para el eritrovirus B19 es aproximadamente del 10% en sujetos menores de 5 años, aproximadamente del 50% en los sujetos de más de 20 años y superior al 90% en las personas mayores.

La tasa elevada de seroprevalencia sugiere que el eritrovirus B19 es muy contagioso. Durante las epidemias, la tasa de transmisión a sujetos en estrecho contacto es del 10 al 60%, siendo principalmente por aire la vía de transmisión (secreciones respiratorias).

El eritrovirus B19 es un virus específicamente humano. La infección aguda conlleva frecuentemente a una erupción cutánea maculo-papulosa benigna en niños (megaleritema epidérmico o 5ª enfermedad). Las artralgias pueden venir acompañadas de erupción y excepcionalmente volverse crónicas.

En los pacientes ya portadores de una anemia hemolítica crónica (drepanocitosis, talasemia, déficit en piruvato quinasa…), habitualmente se produce una crisis eritroblástica aguda transitoria que ocasiona una anemia aguda arregenerativa transitoria.

La infección primaria aguda por el eritrovirus B19 es particularmente peligrosa en gestantes con un riesgo de transmisión al feto calculado del 30%. El riesgo de mortalidad fetal se calcula entre el 5 y el 9% por anemia, insuficiencia hepática, insuficiencia cardiaca y anasarca feto placentaria.

Las infecciones crónicas del eritrovirus B19 se encuentran esencialmente en los sujetos inmunodeprimidos (leucemia mieloide crónica, déficit inmunitario humoral y celular, injertos de órgano o de médula, enfermedades del SIDA).

En pacientes VIH-1 seropositivos, la infección crónica por eritrovirus B19 es responsable de la anemia crónica, pero también puede actuar sobre los otros linajes (neutropenia y sobre todo trombopenia). La ausencia de suficiente respuesta inmunitaria humoral en estos pacientes permite la instalación de una eritroviremia crónica y explica a la vez la eritroblastopenia crónica y la ausencia de otros síntomas tales como la erupción o las artralgias.

El eritrovirus B19 es un virus de ADN genómico unicatenario de aproximadamente 5,4 kbases; es el único eritrovirus catalogado hasta ahora; todas las fuentes que se han secuenciado y que han sido objeto de una publicación en los bancos de secuencias (GenBank o EMBL) presentan una escasa variabilidad genética, (98% de similitud de secuencia de nucleótidos sobre el conjunto del genoma y el 96% de similitud sobre la región VP1) (R.O. SHADE, J. Virol., 1986, 58, 3, 921-936, B19-AU).

El diagnóstico virológico de infecciones por eritrovirus B19 se basa esencialmente en la detección del genoma viral, en la medida en la que el cultivo no puede realizarse de manera rutinaria.

Para las infecciones agudas, por eritrovirus B19 (infecciones primarias), esta detección puede realizarse por amplificación génica (PCR), pero también por hibridación (transferencia puntual), teniendo en cuenta el título viral, habitualmente muy elevado durante las infecciones primarias (hasta 1014 ml en suero); sin embargo, el título viral es mucho más bajo durante infecciones crónicas y sólo es factible un método de detección por amplificación génica.

Estas técnicas de detección dependen de la variabilidad genética del virus investigado; de los reactivos, preparados a partir de secuencias conocidas del eritrovirus B19, que no permiten detectar las infecciones por eritrovirus que varían, ni por amplificación génica, ni por serodiagnóstico B19.

De hecho, los ensayos serodiagnósticos existentes son específicos del eritrovirus B19 (Solicitud Internacional PCT WO 91/12269; Solicitud Internacional PCT WO 96/09391 (IDEIA Parvovirus B19 IgG et IgM, DAKO; Parvovirus B19 IgG et IgM Enzyme Inmunoassay, BIOTRIN)).

Como consecuencia, las técnicas de detección indicadas anteriormente corren el riesgo de producir resultados negativos tanto a nivel nucleico como en lo que concierne a la respuesta de anticuerpos.

La puesta de manifiesto y la consideración de nuevas variantes son importantes para desarrollar:

- reactivos de detección y de diagnóstico de infecciones por eritrovirus en seres humanos (serodiagnóstico, PCR, hibridación), suficientemente sensibles y específicos, es decir que no conducen a resultados falsos negativos o falsos positivos,

- composiciones adecuadas para proteger frente a todas las infecciones por eritrovirus (vacunas) y

- composiciones adecuadas para tratar una infección por eritrovirus variante (sueroterapia, anticuerpos monoclonales).

Los inventores han tenido por objeto proporcionar las secuencias procedentes del eritrovirus, adecuadas para permitir la detección de un eritrovirus variante (denominado eritrovirus de tipo V9), es decir genéticamente alejado del eritrovirus B19.

La presente invención tiene por objeto un eritrovirus variante con respecto al eritrovirus de tipo B19, denominado eritrovirus de tipo V9, caracterizado por que presenta una divergencia genética < o igual al 6% con la secuencia SEC ID Nº:1, y por que su genoma se hibrida específicamente en condiciones rigurosas con una de las secuencias SEC ID Nº:45 a 80, 108 y 110 y por que dicho eritrovirus V9 no puede reconocerse molecularmente como un genoma de eritrovirus B19, ya que presenta una divergencia genética superior o igual al 10% sobre el conjunto del genoma con respecto a las secuencias del eritrovirus B19.

El genoma viral de dicho eritrovirus V9 está considerado como genéticamente alejado del eritrovirus B19.

La presente invención también tiene por objeto un polinucleótido, caracterizado por que se selecciona del grupo constituido por:

a) el genoma del eritrovirus del tipo V9 tal como se define anteriormente, cuyo genoma presenta una secuencia seleccionada del grupo constituido por:

- las secuencias que presentan una divergencia genética  al 10% sobre el conjunto del genoma con respecto a las secuencias del eritrovirus B19 y que presentan una divergencia genética inferior o igual al 6% con respecto a la SEC ID Nº:1, y

- las secuencias que pueden hibridarse en condiciones rigurosas con una de las secuencias SEC ID Nº:45 a 80, 108 y 110, y

b) el polinucleótido de secuencia SEC ID Nº:1 que representa el 95% del genoma del eritrovirus V9 tal como se define anteriormente, incluyendo todas las secuencias codificantes.

Se entiende por condiciones rigurosas, en el sentido de la presente invención, las

siguientes condiciones:  hibridación durante 3 a 24 h en un tampón 1XSSC que contiene el 50% de formamida, a 42ºC y

 3 lavados de 15 min. en un tampón 2XSSC, a 60ºC. La secuencia SEC ID Nº:1, que corresponde aproximadamente al 90% del genoma de un eritrovirus de tipo V9 y que incluye todas las secuencias codificantes, presenta un mapa de restricción diferente al de los eritrovirus B19, particularmente en lo que concierne a los sitios BamHI (cualquier sitio), HindIII (un sólo sitio) y PvuII (cinco sitios). De manera más precisa, la secuencia SEC ID Nº:1 presenta un perfil de restricción diferente al del eritrovirus B19, particularmente por los sitios de restricción siguientes: Acc I, Afl III, Alw I, AlwN I, Apa I, Ava I, Ava II, Avr II, BamH I, Ban I, Ban II, BbeI, Bbs I, BceF I, Bcg I, Bcn I, Bgl II, Bsg I, BsiE I, Bsm I, BsmA I, Bsp 120 I, BspH I, BspM I, BsrF I, Bst1107 I, BstE II, BstU I, Bstu36 I, Dnp I, Dra II, Dsa I, Eae I, Eag I, Ear I, Ecl136 I, EcoN I, Eco 109 I, EcoRI, Ehe I, Fok I, Hae I, Hae III, Hga I, HgiA I,Hha I, Hinc II, Hind III, hinP I, Hpa I Kas I, Mae II, Mbo I, Mcr I, Msc I, Mun I, Nar I Nci I, Nco I, Nsi I, NspI, Nsp7524 I, NspB II, NspC I, PflM I, Pme I, Ppu10 I, PpuM I, Pst I, Pvu II, Sac I, Sau3A I, Sca I, SfaN I, Sfc I, Sma I, Spe I, Sph I, Ssp I, Stu I, Sty I Swa I Tth11 I, Xba I, Xma I y sus isoesquizómeros, de acuerdo con las figuras 7.1 a 7.3.

La presente invención también tiene por objeto un fragmento de la secuencia SEC ID Nº:1, tal como se define anteriormente, caracterizado por que representa una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de dicho eritrovirus...

1. Un eritrovirus variante en relación al eritrovirus de tipo B19, denominado eritrovirus de tipo V9, caracterizado por que presenta una divergencia genética < o igual al 6% con la secuencia SEC ID Nº:1, y por que su genoma se hibrida específicamente en condiciones rigurosas con una de las secuencias SEC ID Nº:45 a 80, 108 y 110 y por que dicho eritrovirus V9 no puede reconocerse molecularmente como un genoma del eritrovirus B19, ya que presenta una divergencia genética superior o igual al 10% sobre el conjunto del genoma en comparación con las secuencias del eritrovirus B19.

2. Un polinucleótido caracterizado porque se selecciona del grupo constituido por:

a) el genoma del eritrovirus de tipo V9 tal como se define en la reivindicación 1, presentando este genoma una secuencia seleccionada del grupo constituido por:

- las secuencias que presentan una divergencia genética  10% sobre el conjunto del genoma en comparación con las secuencias del eritrovirus B19 y que presentan una divergencia genética menor o igual al 6% en comparación con la SEC ID Nº:1, y

- las secuencias que pueden hibridarse en condiciones rigurosas con una de las secuencias SEC ID Nº: 45 a 80, 108 y 110 y

b) el polinucleótido de la secuencia SEC ID Nº:1, que representa el 95% del genoma del eritrovirus V9 tal como se define en la reivindicación 1, incluyendo todas las secuencias codificantes.

3. Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado por que presenta un perfil de restricción de acuerdo con las figuras 7.1 a 7.3.

4. Un fragmento de la secuencia SEC ID Nº:1, caracterizado por que representa una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de dicho eritrovirus V9, seleccionada del grupo constituido por las secuencias SEC ID Nº:81, SEC ID Nº: 83, SEC ID Nº:85, SEC ID Nº:87, SEC ID Nº:89, SEC ID Nº:91 y SEC ID Nº:93.

5. Un fragmento de la secuencia SEC ID Nº:1, caracterizado por que se selecciona del grupo constituido por las secuencias SEC ID Nº:45-80, 108 y Nº:110, sus secuencias complementarias, las secuencias de al menos 17 nucleótidos, resultantes de estas secuencias y las secuencias que comprenden dichas secuencias y por que es adecuado para su uso como una sonda o cebador en la identificación específica de un eritrovirus de tipo V9 o un eritrovirus que presenta una divergencia genética menor o igual al 6% en comparación con la SEC ID Nº:1.

6. Un fragmento de la secuencias SEC ID Nº:1, caracterizado por que se selecciona del grupo constituido por las secuencias SEC ID Nº:2 a 44, 105 a 107, 109 y 111 a 121 y las secuencias complementarias de las secuencias anteriores, y por que es adecuado para su uso como una sonda o cebador para el diagnóstico diferencial de eritrovirus.

7. Pares de cebadores, caracterizados por que se seleccionan del grupo constituido por:

- el par A: cebadores SEC ID Nº:111 y SEC ID Nº:112;

- el par B: cebadores SEC ID Nº:105 y SEC ID Nº:106

- el par C: una de las secuencias SEC ID Nº:2-44, 105, 106, 107, 109, 111 ó 112 y una de las secuencias SEC ID Nº:45-80, 108 ó 110;

- el par D: cebador SEC ID Nº:107 y cebador SEC ID Nº:109;

- el par E: dos cebadores seleccionados entre las secuencias SEC ID Nº:2-44, 105, 106, 107, 109, 111 ó 112; y

- el par F: dos cebadores seleccionados entre las secuencias SEC ID Nº: 45-80, 108 ó 110.

8. Sondas, caracterizadas por que se seleccionan del grupo constituido por las secuencias SEC ID Nº:45 a 80, 108, 110 y 121.

9. Un plásmido, caracterizado por que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 2 o la reivindicación 3 o un fragmento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.

10. Un plásmido de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado por que incluye la secuencia SEC ID Nº:1.

11. El uso de una molécula de ácido nucleico seleccionada entre las secuencias SEC ID Nº:45-80, 108 y 110, sus secuencias complementarias, las secuencias de al menos 17 nucleótidos, resultantes de estas secuencias, eventualmente marcadas con un marcador apropiado, para la preparación de un reactivo de diagnóstico para la detección diferencial de eritrovirus de tipo V9.

12. Procedimiento de diagnóstico rápido y diferencial de eritrovirus, por hibridación y/o amplificación génica, realizado en una muestra biológica, caracterizándose dicho procedimiento por que comprende:

(1) una etapa en la que la muestra biológica a analizar se pone en contacto con al menos una sonda de las secuencias SEC ID Nº:45-80, 108 ó 110 y

(2) una etapa en la que el producto (o productos) resultante de la interacción entre la secuencia de nucleótidos del eritrovirus y la sonda se detecta mediante cualquier medio apropiado.

13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado por que, antes de la etapa (1), comprende:

- una etapa de extracción del ácido nucleico a detectar, que pertenece al genoma del virus, eventualmente presente en la muestra biológica, y

- al menos un ciclo de amplificación génica.

14. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado por que los ciclos de amplificación se realizan usando un par de cebadores de acuerdo con las reivindicación 7.

15. Un procedimiento de diagnóstico rápido y diferencial de eritrovirus, realizado en una muestra biológica, caracterizándose dicho procedimiento por que comprende:

- una etapa de extracción del ácido nucleico a detectar, que pertenece al genoma del virus, eventualmente presente en la muestra biológica,

- al menos un ciclo de amplificación génica usando el par de cebadores B tal como se define en la reivindicación 7 y

- la detección del producto amplificado en parte por hibridación con la sonda de la secuencia SEC ID Nº:121 y en parte por la acción de la enzima de restricción MunI.

16. Un procedimiento de diagnóstico rápido y diferencial de eritrovirus, realizado en una muestra biológica, caracterizándose dicho procedimiento por que comprende:

- una etapa de extracción del ácido nucleico a detectar, que pertenece al genoma del virus, eventualmente presente en la muestra biológica,

- al menos un ciclo de amplificación génica usando el par de cebadores A tal como se define en la reivindicación 7 y

- la detección del producto amplificado por acción de la enzima de restricción ApaI.

17. Un procedimiento de diagnóstico rápido y diferencial de eritrovirus, realizado en una muestra biológica, caracterizándose dicho procedimiento por que comprende:

- una etapa de extracción de ácido nucleico a detectar, que pertenece al genoma del virus, eventualmente presente en la muestra biológica,

- al menos un ciclo de amplificación génica usando el par de cebadores C tal como se define en la reivindicación 7 y

- la detección del producto amplificado.

18. Un procedimiento de diagnóstico rápido y diferencial de eritrovirus, realizado en una muestra biológica, caracterizándose dicho procedimiento por que comprende:

- una etapa de extracción del ácido nucleico a detectar, que pertenece al genoma del virus, eventualmente presente en la muestra biológica,

- al menos un ciclo de amplificación génica usando el par de cebadores D tal como se define en la reivindicación 7 y

- la detección del producto amplificado por hibridación con una sonda cuya secuencia se selecciona del grupo constituido por las secuencias SEC ID Nº:58-60 y 110.

19. Un procedimiento de diagnóstico rápido y diferencial de eritrovirus, realizado en una muestra biológica, caracterizándose dicho procedimiento por que comprende:

- una etapa de extracción del ácido nucleico a detectar, que pertenece al genoma del virus, eventualmente presente en la muestra biológica,

- al menos un ciclo de amplificación génica usando el par de cebadores E tal como se define en la reivindicación 7 y

- la detección del producto amplificado por hibridación con una sonda cuya secuencia se selecciona del grupo constituido por las secuencias SEC ID Nº:45-80, 108 y 110.

20. Un procedimiento de diagnóstico rápido y diferencial de eritrovirus, realizado en una muestra biológica, caracterizándose dicho procedimiento por que comprende:

- una etapa de extracción del ácido nucleico a detectar, que pertenece al genoma del virus, eventualmente presente en la muestra biológica,

- al menos un ciclo de amplificación génica usando el par de cebadores F tal como se define en la reivindicación 7 y

- la detección del producto amplificado.

21. El uso de las secuencias tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6 para la implementación de un procedimiento de hibridación o de amplificación génica de las secuencias de nucleótidos del eritrovirus para el diagnóstico in vitro de una posible infección de un individuo por un eritrovirus.

22. Procedimiento de exploración y de tipificación de un eritrovirus V9 o afín, caracterizado por que comprende poner en contacto una sonda seleccionada del grupo constituido por los fragmentos de acuerdo con la reivindicación 5, eventualmente marcada, con

5 el ácido nucleico del virus a tipificar, eventualmente marcado y la detección del híbrido ácido nucleico-sonda obtenido.

23. Kit de diagnóstico de eritrovirus, caracterizado por que incluye al menos un par de cebadores de acuerdo con la reivindicación 7 y/o una sonda de acuerdo con la reivindicación