Detección de bacteriófagos que infectan Lactobacillus delbrueckii mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa a tiempo real (QRT-PCR) y su uso.

La presente invención describe un procedimiento de detección, especialmente en leche, de trazas de bacteriófagos destructivos de la especie Lactobacillus delbrueckii utilizada en fermentaciones lácticas industriales, mediante QRT-PCR. La amplificación se realiza utilizando una única pareja de oligonucleótidos cebadores que bajo unas condiciones adecuadas amplifican un fragmento de doble cadena flanqueado por dichos oligonucleótidos. Estos virus son una de las principales causas de fallo en las fermentaciones lácteas industriales, provocando importantes pérdidas económicas. Este procedimiento permite tomar decisiones tales como destinar la leche contaminada hacia procesos donde no intervenga Lb. delbrueckii sensibles a los fagos detectados o hacia tratamientos de inactivación, así como la desinfección de la planta de producción. La principal ventaja del procedimiento es la rapidez, junto con la especificidad, la sencillez y la sensibilidad

Detección de bacteriófagos que infectan Lactobacillus delbrueckii mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa a tiempo real (QRT-PCR) y su uso.

Sector de la técnica

Industria alimentaria. Diagnóstico mediante la técnica de QRT-PCR. El método desarrollado puede ser aplicado en cualquier paso de los procesos de fermentación industrial en los que participen Lb. delbrueckii como cultivos iniciadores o como microbiota secundaria, principalmente en el sector lácteo.

Estado de la técnica

Lb. delbrueckii, especie perteneciente al grupo de bacterias del ácido láctico (BAL), es un microorganismo esencial en la Industria Alimentaria como iniciadores de la fermentación, y en particular en la industria láctea. Cualquier agente o factor capaz de retrasar o frenar el crecimiento de dicha bacteria, va a generar dificultades tecnológicas durante los procesos fermentativos en que intervengan (variaciones de pH, prolongación de los tiempos de fermentación, etc.), que conducirá a la obtención de productos de baja calidad o, incluso, a fermentaciones totalmente fallidas. Uno de estos problemas viene determinado por la susceptibilidad de las bacterias a la infección por bacteriófagos, que provocará la lisis de las células, la detención del proceso fermentativo y la pérdida de la materia prima, con las consiguientes consecuencias económicas para la industria. La magnitud de este problema es tal que ya se reconoció en 1935 (Whitehead, HR., and GA Cox. 1935. The occurrence of bacteriophage in cultures of lactic streptococci. N. Z. J. Dairy Sci. Technol. 16:319-320), lo que ha provocado la adopción de medidas de protección que ha permitido mantener el problema dentro de límites manejables, pero, desde luego, no lo ha eliminado. El conocimiento en profundidad de este fenómeno es fundamental para controlar los problemas derivados de las infecciones fágicas, mediante la aplicación de estrategias tendentes a minimizarlos.

La contaminación por fagos es un problema importante tanto cualitativamente como cuantitativamente en la producción de derivados fermentados. Las soluciones que se aplican desde de la industria tanto correctivas como preventivas son medidas que pueden contener los efectos pero sin duda la posibilidad de disponer de un procedimiento rápido de detección supondría una mejora sustancial en la prevención y por tanto en las garantías de la producción que satisfaga todos los indicadores de calidad.

Lb. delbrueckii junto con Streptococcus thermophilus son dos especies de BAL de gran importancia en la industria láctea ya que se emplean como iniciadores en la producción de yogur y en algunos tipos de queso. El yogur es un tipo de leche fermentada en la que se utiliza exclusivamente, como cultivo iniciador, una mezcla de St. thermophilus y Lb. delbrueckii subs. bulgaricus. Que, aunque pueden crecer independientemente, establecen una cooperación beneficiosa o protocooperación (Fredickson, AG. 1997. Behavior or mixed cultures of microorganisms. Ann. Rev. Microbiol., 74:611-618), de forma que su combinación produce niveles de ácido láctico y acetaldehído superiores a los que se obtendrían por separado, también se reduce el tiempo de latencia y aumenta la producción de biomasa. Debido a este efecto sinérgico se favorece el crecimiento conjunto de ambas especies (Loones, A. 1994. Latís fermentés par les bacteéries lactiques. En: Bactéries lactiques. H. de Roissart y RM Luquet (Ed.). Lorica, France. pp: 135-154), que son finalmente las responsables del aroma y textura típicos del yogur. El extenso uso que se ha hecho en los últimos años de Lb. delbrueckii como iniciador en la producción de yogures, ha promovido el aumento de fallos en las fermentaciones debido a la selección de bacteriófagos específicos.

Cuando el proceso de acidificación se retrasa durante la fermentación, el procedimiento más usual es analizar la leche inicial para detectar fagos usando métodos microbiológicos estándares (ensayo en placa, test de actividad) (Everson, TC. 1991. Control of phage in the dairy plant. Bull. Int. Dairy Fed. 263:24-28). Estos métodos proporcionan información sobre la sensibilidad del cultivo, pero tienen la desventaja de ser muy lentos (se necesitan varios días). Por otro lado, las técnicas de biología molecular como las sondas de DNA (Moineau, S, J Portier, and S Pandian. 1992. Direct detection of lactococcal bacteriophages in cheese whey using DNA probes. FEMS Microbiol. Lett. 92:169-174) y los ensayos ELISA (Lembke, J, and M Teuber. 179. Detection of bacteriophages in whey by enzyme-linked immunosorbent assay. Milchwissenschaft 34:457-458; Moineau, S, D Bernier, M Jobin, J Hébert, TR Klaenhammer, and S Pandian. 1993. Producction of monoclonal antibodies against the major capsid protein of the Lactococcus bacteriophage u136 and development of and enzyme-linked immunosorbent assay for sirect phage detection in whey and milk. Appl. Environ. Microbiol. 59:2034-2040) permiten detectar especies de fagos, pero no detectan ciclos de actividad lítica. Además, estas técnicas moleculares tienen una baja sensibilidad de detección (10⁷ PFU/ml).

A comienzos de la década de los 80, la PCR revolucionó la biotecnología molecular y desde entonces se ha convertido en una herramienta vital para de investigación y la detección (Saiki, RK, DH Gelfand, S Stoffel, SJ Scharf, R Higuchi, GT Horn, KB Mullis, and HA Erlich. 1988. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239:487-491). Una única copia de una secuencia en particular, puede ser detectada y amplificada específicamente. La PCR permite detectar e identificar especies de virus presentes en diferentes tipos de muestras mediante el empleo de oligonucleótidos específicos (Brüssow, H, M Fremont, A Bruttin, J Sidote, A Constable, and V Fryder. 1994. Detection and classification of Streptococcus thermophilus bacteriophages isolated from industrial milk fermentation. Appl. Environ Microbiol. 60:4537-4543). La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha sido aplicada con éxito para la detección de bacteriófagos que infectan Lb. delbrueckii (del Rio B, AG Binetti, MC Martín, M Fernández, AH Magadán, MA Alvarez. 2007. Multiplex PCR for the detection and identification of dairy bacteriophages in milk. Food Microbiol. 24:75-81). En estas reacciones el producto final o amplicon es analizado mediante su visualización en geles de agarosa, lo que alarga el proceso. En los últimos años el desarrollo de la PCR cuantitativa en tiempo real permite la amplificación y la detección en un solo paso y ofrece importantes avances frente a la PCR convencional, como son una mayor especificidad y sensibilidad, no es necesario el procesamiento post-PCR de la muestra y permite cuantificar el material genético de partida.

Descripción de la invención

El objeto de la presente invención lo constituye un procedimiento de detección de bacteriófagos que infectan cepas de Lb. delbrueckii de forma rápida y sensible. La detección se realiza mediante amplificación del gen mur por la técnica de reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real (QRT-PCR) usando una pareja de oligonucleótidos cebadores y una sonda Taqman específicos. Este sistema permite la detección de bacteriófagos que infectan cepas de Lb. delbrueckii mediante el uso de los oligonucleótidos específicos y de la sonda Taqman, diseñados a partir de la secuencia del gen mur que codifica una muramidasa fágica, y bajo unas condiciones adecuadas para la amplificación específica de los fragmentos de doble cadena flanqueados por los cebadores.

La novedad de la presente invención radica en el uso conjunto de la pareja de oligonucleótidos cebadores, de la sonda Taqman y del procedimiento de QRT-PCR, para la detección e identificación rápida del gen mur.

Finalmente, otro objeto de la presente invención lo constituye un kit de detección de bacteriófagos que infectan cepas de Lb. delbrueckii por QRT-PCR mediante el gen mur de Lb. delbrueckiii que utilice para ello cualquier combinación posible de cebadores y sonda Taqman que contenga la presente invención. Las ventajas más importantes del procedimiento que se propone, son, además de la especificidad y la sencillez, la altísima sensibilidad y rapidez. En cuanto a la especificidad, por métodos clásicos es necesario realizar un ensayo para cada tipo de fago que se quiera detectar y el resultado siempre dependerá del tipo de cepa que se utilice como hospedadora, ya que estos fagos tienen un estrechísimo...

1. Procedimiento de detección de fagos que infectan Lb. delbrueckii caracterizado por el uso de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (QRT-PCR) mediante una única reacción con los oligonucleótidos de secuencia SEQ ID NO1 y SEQ ID NO2.y sonda Taqman comprendida entre los oligonucleótidos cebadores indicados de secuencia SEQ ID NO3 específicos del gen mur del bacteriófago LL-H que infecta Lb. delbrueckii y sus equivalentes en otras especies bacterianas.

2. Procedimiento de detección de fagos que infectan Lb. delbrueckii según la reivindicación 1 caracterizado porque la técnica de QRT-PCR para la amplificación de los fragmentos de doble cadena se realiza con las parejas de oligonucleótidos específicos y una sonda Taqman según la reivindicación 1 del gen mur del bacteriófago LL-H que infecta Lb. delbrueckii y sus equivalentes en otros fagos y bajo las siguientes condiciones preferentes:

medbullet un ciclo de desnaturalización a 94ºC durante 20 segundos.

medbullet 40 ciclos:

3. Procedimiento de detección de fagos que infectan Lb. delbrueckii según las reivindicaciones 1 a 2 caracterizado por utilizar como material de partida sustratos, tanto vegetales como animales, susceptibles de fermentaciones alimentarias.

4. Procedimiento de detección de fagos que infectan Lb. delbrueckii según la reivindicación 3 caracterizado porque el material de partida productos de origen animal que se utiliza es leche o derivados lácteos.

5. Procedimiento de detección de fagos que infectan Lb. delbrueckii según la reivindicación 3 caracterizado porque el material de partida productos de origen animal que se utiliza es carne o pescado susceptible de ser sustrato de fermentación.

6. Pareja de oligonucleótidos cebadores específicos del gen mur del bacteriófago LL-H que infecta Lb. delbrueckii y sus equivalentes en otros fagos, caracterizados por la secuencia SEQ ID NO1 y SEQ ID NO2.y porque permiten la amplificación específica de dichos genes por QRT-PCR según el procedimiento indicado en las reivindicaciones 1 a 5.

7. Sonda Taqman específica del gen mur del bacteriófago LL-H que infecta Lb. delbrueckii y sus equivalentes en otros fagos, caracterizado por la secuencia SEQ ID NO3 y porque permiten la amplificación específica de dichos genes por QRT-PCR según el procedimiento indicado en las reivindicaciones 1 a 5.

8. Kit de diagnóstico por QRT-PCR para la detección de de fagos que infectan Lb. delbrueckii caracterizado por amplificar el gen mur del bacteriófago LL-H que infecta Lb. delbrueckii y sus equivalentes en otros fagos, por el procedimiento indicado en las reivindicaciones 1 a 5 y que contenga los oligonucleótidos específicos según las reivindicaciones 6 y 7.

9. Uso del procedimiento de las reivindicaciones 1 a 5 y de los oligonucleótidos específicos para la amplificación por QRT-PCR del gen mur del bacteriófago LL-H que infecta Lb. delbrueckii y sus equivalentes en otros fagos, según las reivindicaciones 6 a 8 para la detección de fagos que infectan Lb. delbrueckii en alimentos en general y productos vegetales y/o animales en particular, así como en aditivos de los mismos y en los cultivos iniciadores.

10. Uso del procedimiento de las reivindicaciones 1 a 5 y de los oligonucleótidos específicos para la amplificación por QRT-PCR del gen mur del bacteriófago LL-H que infecta Lb. delbrueckii y sus equivalentes en otros fagos, según las reivindicaciones 6 a 9 en muestras de leche para la posterior decisión del uso la misma.

11. Uso del procedimiento de las reivindicaciones 1 a 5 y de los oligonucleótidos específicos para la amplificación por QRT-PCR del gen mur del bacteriófago LL-H que infecta Lb. delbrueckii y sus equivalentes en otros fagos, según las reivindicaciones 6 a 9 para la detección en muestras productos lácteos fermentados, entre ellos el yogur.