MULTÍMERO PARA LA INMUNOESTIMULACIÓN.
Molécula multimérica para la modulación de la actividad del sistema inmune humano o animal que se puede preparar mediante un procedimiento que comprende las siguientes etapas:
- proporción de una secuencia de ácido oligodesoxirribonucleico 5-fosforilado en agua, - liofilización hasta que se obtiene un residuo seco y a continuación resuspensión en una solución tampón, - adición de una ADNligasa de T4, por lo que se obtiene una mezcla de reacción e - incubación de la mezcla de reacción a 37ºC durante al menos 30 minutos
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/DE2007/000887.
Solicitante: MOLOGEN AG.
Nacionalidad solicitante: Alemania.
Dirección: FABECKSTRASSE 30 14195 BERLIN ALEMANIA.
Inventor/es: SCHROFF, MATTHIAS, WITTIG, BURGHARDT, SCHMIDT,Manuel, LÖHR,Janine.
Fecha de Publicación: .
Fecha Solicitud PCT: 11 de Mayo de 2007.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12N15/117 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Acidos nucleicos que tienen propiedades inmunomoduladoras, p.ej. que contienen motivos CpG.
Clasificación PCT:
- C12N15/11 C12N 15/00 […] › Fragmentos de ADN o de ARN; sus formas modificadas (ADN o ARN no empleado en tecnología de recombinación C07H 21/00).
Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.
PDF original: ES-2357692_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
Multímero para la inmunoestimulación.
La invención se refiere a una molécula de ácido nucleico no codificante multimérica para la modulación de la actividad del sistema inmune humano o animal así como a un procedimiento de preparación de la misma y a una vacuna que contiene la molécula de ácido nucleico no codificante multimérica.
Mientras que la respuesta inmune adaptativa después de la selección de los linfocitos específicos para el respectivo patógeno y su expansión clonal y diferenciación hasta células efectoras aparece tan sólo de forma retardada (3-5 días) y, sin embargo, después ofrece una protección de larga duración contra el respectivo patógeno mediante configuración de una "memoria inmunológica", las células del sistema inmune innato reconocen los patógenos mediante patrones moleculares asociados a patógeno (pathogen associated molecular patterns = PAMP) conservados con receptores codificados por células germinales y reaccionan inmediatamente. A las diferentes reacciones para los diversos tipos celulares pertenecen la secreción de citocinas (por ejemplo, IL-1, IL-6, TNF-α) y quimiocinas (por ejemplo, IL-8/CXCL8, MIP-1α/β, MCP-1), activación de mecanismos efectores (fagocitosis, estallido respiratorio, liberación de sustancias bactericidas o gránulos líticos), expresión de moléculas coestimuladoras (CD80, CD86) así como expresión aumentada de moléculas de CMH. De este modo por un lado se reclutan y activan células efectoras que pueden eliminar el patógeno que ha penetrado y por otro lado las células del sistema inmune adaptativo obtienen las señales necesarias para su activación.
Para la generación de una respuesta inmune mejorada se utilizaron oligonucleótidos CpG (ODN-CpG) como nueva clase de moléculas inmunomoduladoras. Tales motivos CG no metilados aparecen en el ADN bacteriano y representan para el sistema inmune una "señal de peligro". Como "patrón molecular asociado a patógeno" (PAMP) llevan a cabo sobre todo la activación inespecífica del sistema inmune innato (Krieg, Nat. Med 2003, 9: 831-835).
Los ODN-CpG inducen mediante las citocinas interleucina-12, interferón-gamma y factor de necrosis tumoral alfa una respuesta inmune marcada por TH1.
Las secuencias de ácido nucleico inmunoestimuladoras (ISS) que llevan los ODN-CpG conocidos solamente tienen algunas bases de longitud y no actúan mediante la expresión de proteínas codificadas en las mismas.
En el caso de las ISS se trata de moléculas de ácido nucleico cerradas covalentemente. Están compuestas de oligonucleótidos, cuyas bases se pueden emparejar consigo mismo parcialmente y uno o dos bucles de horquilla (loop) que comprenden 30 bases y que contienen varios motivos CG y que se denominan por lo demás moléculas portadoras.
La fuerte estimulación de la respuesta inmune celular posibilita influir sobre circuitos de, que sin intervención no conducen a una actividad inmune satisfactoria para el paciente.
La modificación de ODN-CpG con cadena principal de fosforotioato, tal como se utiliza para la estabilización de "ADN-CpG", presenta algunas desventajas agravantes. A éstas pertenecen particularmente la toxicidad observada [Heikenwalder 2004, Levin 1999] así como la unión inespecífica a proteínas [Brown 1994].
Por este motivo se desarrolló una nueva clase de ADN inmunoestimulador cerrado covalentemente (documento EP 1196178). Estas moléculas de ADN están compuestas de dos moléculas de ADN sintetizadas químicamente, que presentan una región auto-complementaria en el extremo 5' y en el 3' con extremos palindrómicos, solapantes, de tal forma que mediante la ligación de las dos moléculas de ADN se produce una molécula cerrada covalentemente. Estas moléculas de ADN con motivos CG en la región no complementaria muestran una actividad similar a ODN-CpG (expresión aumentada de las moléculas de superficie CD80, CD40, CMH en linfocitos B y secreción de IL-6, IFN-γ, IFN-α, IL-12, TNFα por PBMC), sin embargo presentan en comparación con ODN-CpG con cadena principal de fosforotioato diferencias en el patrón de expresión y una toxicidad claramente menor en ratones. Sin embargo, este ADN inmunoestimulador del estado de la técnica presenta con respecto a la modulación de la actividad del sistema inmune humano o animal algunas desventajas. No siempre es posible modular, particularmente activar, la actividad del sistema inmune humano o animal con la intensidad deseada.
Partiendo de este estado de la técnica es objetivo de la presente invención proporcionar moléculas de ADN inmunoestimuladoras adecuadas, que sean capaces de desencadenar una respuesta inmune mejorada, así como un procedimiento para su preparación así como vacunas que contienen estas moléculas de ADN inmunoestimula- doras.
La inmunoestimulación significa en el contexto de la presente invención que las células mediadoras y efectoras del sistema inmune, es decir, sobre todo los timocitos conocidos actualmente con función auxiliar y los timocitos citotóxicos, linfocitos B y los denominados linfocitos NK (linfocitos citolíticos naturales), macrófagos y monocitos así como células dendríticas y sus precursores, así como poblaciones celulares hasta ahora no aclaradas en cuanto a su función con funciones dentro del sistema inmune, se estimulan mediante el uso de moléculas de ácido nucleico para la proliferación, migración, diferenciación o actividad. Inmunomodulación quiere decir que además de una estimulación general en el sentido que se ha definido anteriormente también se influye en el tipo o el carácter de una reacción inmune, bien sea que se vea afectada por ello una reacción inmune que se encuentra en generación o maduración, bien sea que una reacción ya establecida se modifique en su carácter.
La presente invención resuelve el objetivo proporcionando una molécula de ácido nucleico no codificante multimérica. La molécula multimérica se puede preparar mediante un procedimiento que comprende las siguientes etapas:
Fue completamente sorprendente que la secuencia de las etapas que se han mencionado condujera a una molécula multimérica que se puede usar mejor que las moléculas del estado para la modulación de la actividad del sistema inmune humano o animal. Una molécula multimérica en el sentido de la invención es una molécula esencialmente de ácido desoxirribonucleico, presentando la molécula de ácido nucleico preferentemente una longitud de al menos 100 nucleótidos, preferentemente 200, más preferentemente más de 300. Mientras que en el documento EP 1 196 178 se desvelan moléculas que se pueden denominar monómero con su estructura de tallo-bucle, mediante el procedimiento de acuerdo con la invención se proporcionan moléculas en las que varias de estas estructuras monoméricas de tallo-bucle se ensamblan hasta estructuras multiméricas u oligoméricas. Los ensamblados obtenidos son sorprendentemente eficaces en la modulación del sistema inmune. Además fue sorprendente que las etapas del procedimiento que se han mencionado anteriormente en sí sencillas y típicas de laboratorio conducen a la configuración de estructuras eficaces. En comparación con las estructuras de acuerdo con el documento EP 1 196 178, las moléculas multiméricas de acuerdo con la invención representan complejos moleculares tempranos.
En una realización preferente de la invención, el ensamblado oligomérico o multimérico, es decir, la molécula de acuerdo con la invención, se caracteriza porque la secuencia de ácido oligodesoxirribonucleico comprende las siguientes secuencias
Reivindicaciones:
1. Molécula multimérica para la modulación de la actividad del sistema inmune humano o animal que se puede preparar mediante un procedimiento que comprende las siguientes etapas:
2. Molécula de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia de oligodesoxirribonucleótidos comprende las siguientes secuencias:
3. Molécula de acuerdo con la reivindicación precedente, caracterizada porque la secuencia de bases de acuerdo con la característica c) está contenida en la secuencia CCTAGGGGTT ACCACCTTCA TTGGAAAACG TTCTTC GGGG CGTTCTTAGG TGGTAACC CCTAGGGGTT ACCACCTTCA TTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGTTC TTAGG TGGTAACC.
4. Molécula de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la molécula comprende una cadena parcialmente monocatenaria, cerrada covalentemente de restos de desoxirribonucleósido.
5. Molécula de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la molécula comprende la secuencia de bases N1N2CGN3N4, siendo N1N2 un elemento del grupo GT, GG, GA, AT o AA, N3N4 un elemento del grupo CT o TT, así como C desoxicitosina, G desoxiguanosina, A desoxiadenosina y T desoxitimidina.
6. Molécula de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la secuencia de bases N1N2CGN3N4 está colocada en la zona monocatenaria de la cadena cerrada de restos de desoxirribonucleósido.
7. Molécula de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque uno o varios sustituyentes están unidos mediante enlaces covalentes a la molécula.
8. Molécula de acuerdo con la reivindicación 7, en la que el sustituyente está seleccionado entre uno de los grupos que comprenden péptidos, proteínas, sacáridos, estructuras antigénicas, ADN y/o ARN.
9. Agente de combinación, caracterizado porque comprende una molécula de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6 y un agente quimioterapéutico.
10. Agente de combinación de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el agente quimioterapéutico se selecciona entre el grupo que comprende anticuerpos, alquilantes, análogos de platino, intercaladores, antibióticos, inhibidores de la mitosis, taxanos, inhibidores de la topoisomerasa, antimetabolitos y/o L-asparaginasa, hidroxicarbamida, mitotano y/o amanitina.
11. Agente de combinación de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los alquilantes se seleccionan entre el grupo que comprende:
- derivados de mostaza de nitrógeno, particularmente
- alquilsulfonatos, particularmente
- nitrosoureas, particularmente
- procarbazina y dacarbazina,
- temozolomida y/o
- tiotepa
y/o porque los análogos de platino se seleccionan entre el grupo que comprende:
- cisplatino,
- carboplatino y/o
- oxaliplatino
y/o porque los intercaladores se seleccionan entre el grupo que comprende:
- antraciclinas, particularmente
- mitoxantrona,
- amsacrina y/o
- doxifluridina
y/o porque los antibióticos se seleccionan entre el grupo que comprende:
- bleomicina,
- actinomicina D (dactinomicina) y/o
- mitomicina
y/o porque los inhibidores de la mitosis se seleccionan entre el grupo que comprende:
- alcaloides de la Vinca rosea, particularmente
y/o porque los taxanos se seleccionan entre el grupo que comprende:
- paclitaxel y/o
- docetaxel
y/o porque los inhibidores de la topoisomerasa se seleccionan entre el grupo que comprende:
- inhibidores de la topoisomerasa-I, particularmente
- inhibidores de la topoisomerasa-II, particularmente
y/o porque los antimetabolitos se seleccionan entre el grupo que comprende:
- antagonista de ácido fólico, particularmente
- análogos de pirimidina, particularmente
- análogos de purina, particularmente
12. Molécula de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8 y/o agente de combinación de acuerdo con una de las reivindicaciones 9 a 11 para el uso como fármaco.
13. Uso de una molécula de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8 y/o un agente de combinación de acuerdo con una de las reivindicaciones 9 a 11 para la fabricación de un agente para la modulación de un sistema inmune humano o animal o para la modulación de la actividad del sistema inmune, siendo preferentemente la modulación una estimulación o un aumento de la actividad del sistema inmune.
14. Uso de acuerdo con la reivindicación precedente, caracterizado porque la estimulación comprende una respuesta inmune mediada por o independiente de linfocitos T, preferentemente la respuesta inmune comprende una proliferación de linfocitos B y/o una activación de linfocitos B.
15. Uso de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la estimulación del sistema inmune comprende una secreción de citocinas.
16. Uso de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la molécula de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8 y/o el agente de combinación de acuerdo con una de las reivindicaciones 9 a 11 se utiliza como adyuvante en la vacunación terapéutica o profiláctica.
17. Uso de una molécula de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8 y/o un agente de combinación de acuerdo con una de las reivindicaciones 9 a 11 para la fabricación de un agente para el tratamiento de una alteración del crecimiento celular, siendo preferentemente la alteración del crecimiento celular una enfermedad tumoral.
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