AGENTE TERAPÉUTICO ANTITUMOR ALOGENO.

Vacuna para el tratamiento de pacientes con enfermedades tumorales,

que contiene células tumorales alógenas y oligodesoxirribonucleótidos inmunomoduladores como adyuvante, en donde se transfectaron las células tumorales en primer lugar ex-vivo con moléculas de ácido nucleico que codifican interleuquina-7 (IL-7), factor estimulador de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF), CD40L/CD154 y B7.1/CD80.

La invención se refiere a una vacuna basada en células tumorales alógenas para el tratamiento terapéutico de enfermedades tumorales, así como a un procedimiento para la preparación de tales vacunas, además de células tumorales humanas transfectadas para el uso como vacuna.

Además de los procedimientos de tratamiento convencionales de enfermedades cancerígenas, como la radioterapia y la quimioterapia, que constituyen desde los años 50 la única opción de tratamiento para enfermedades tumorales progresivas y muy dispersas, la inmunoterapia parece ser en tumores metastásicos un nuevo enfoque prometedor.

La inmunoterapia tiene como finalidad reforzar la respuesta inmune natural frente a la enfermedad tumoral mediante modificaciones de ingeniería genética, es decir, influir sobre la “atención” del sistema inmune frente a células cancerígenas, y con ello la reacción de defensa, de tal manera que el propio cuerpo combate el tumor.

Debido a que algunas enfermedades malignas como, por ejemplo, el carcinoma de células renales progresivo, parecen ser relativamente sensibles a los tratamientos inmunoterapéuticos, la terapia sistémica con citoquinas como IL-2 e IFN-alfa conlleva por ejemplo efectos secundarios considerables, se desarrollaron otros protocolos inmunoterapéuticos.

La mayoría de los estudios clínicos conducen hoy en día a la extirpación del tumor, a continuación a una transfección ex-vivo de las células tumorales con un gen terapéutico, irradiación de la población de células tumorales y subsiguiente reimplantación de las células tumorales ahora modificadas. Mediante esta vacunación con células tumorales se puede aumentar en distinta medida la respuesta antitumor en función del gen terapéutico transfectado.

En base a este enfoque así como de los resultados experimentales en animales se autorizó una serie de estudios clínicos de fase I y II (Finke y col., 1997; Witting y col., 2001).

Sin embargo, los primeros resultados con genes terapéuticos singulares transfectados además de una buena tolerabilidad de la terapia sólo en unos pocos casos produjeron remisiones parciales o completas.

En un modelo de ratón de carcinoma de colon la transferencia génica de CD40UCD154 pudo generar un vertido de citoquinas, una erradicación del tumor y una inmunidad (Sun y col, 2000).

Los inventores de la presente solicitud pudieron demostrar que la transferencia de plásmidos de expresión para interleuquina 7 humana (IL-7) en células tumorales conduce a una sensibilidad elevada contra células efectoras del sistema inmune, especialmente en transferencia autóloga (Finke y col., 1997, Cancer Gene Ther, 4:260-268). Igualmente los inventores pudieron demostrar que tras la transfección de dos genes terapéuticos (IL-7, GM-CSF) en células tumorales autólogas se vislumbraba en la mitad de los pacientes tratados una reacción clínica significativa (documento WO 02/060476).

Del documento US 5.681.562 se sabe inyectar pacientes con determinadas células de enfermedades cancerígenas que se transfectaron con ADN o ARN que codifica citoquina. El sistema inmune del paciente se debe estimular contra antígenos de tumores. En el documento de patente se describen ensayos en los que se transfectaron fibroblastos de ratones con vectores retrovirales, que codifican IL-2. Igualmente se describe el ensayo in vivo en el que se ensayó la actividad del tratamiento en un modelo de carcinoma de intestino grueso murino. Los ratones cuyos fibroblastos transfectados se inyectaron desarrollaron, en comparación con los grupos de control, un crecimiento de tumor claramente más lento. En el ensayo in vitro con fibroblastos transfectados humanos se pudo determinar igualmente un nivel de expresión de IL-2 claramente elevado. Además de los datos clínicos erróneos que surgen con el modelo de ratón, los vectores víricos usados como vector de expresión se consideran como poco ventajosos. Debido a la inestabilidad de la cepa de inoculación atenuada no se excluye una reconversión en una cepa virulenta, además pueden actuar propiamente los componentes víricos, lo que conduce a una disminución de su actividad mediante el sistema inmune del paciente. Estos riesgos aparecen con considerable nivel con uso frecuente como vector de terapia génica.

Diversas publicaciones muestran que los mejores resultados terapéuticos se consiguen mediante una combinación de genes de citoquina con el factor de crecimiento GM-CSF (Paillard, 1998, Hum. Gene Ther. 9: 2547-2458; Schadendorf y col., 1995, J. Mol. Med. 73: 473-477). La importancia de GM-CSF se puso de manifiesto en inoculaciones con antígeno de tumor también en el aumento de la respuesta antitumor clínica e inmunológica en vacunaciones de péptido (Jäger y col., 1996). A este respecto desempeña un papel esencial la activación de células dendríticas presentadoras de antígeno así como la estimulación de una población de células efectoras.

Sin embargo, hasta la fecha no está claro qué genes de citoquina en combinación en una composición inmunógena con GM-CSF consiguen la respuesta inmune anti-tumoral más efectiva.

En experimentos en ratones se demostró que una inoculación con construcciones de expresión que codifican IL-7 provoca un efecto anti-tumoral (Miller y col., 1993, Blood 18: 3686-3694; Murphy y col., 1993, J. Clin. Invest. 92: 1918-1924). Igualmente se sabe que la incubación de CTL con IL-7 o células transfectadas con IL-7 conduce a la regresión del tumor en ratones (Jicha y col., 1991; Hock y col., 1993) y se induce la transfección con IL-7 e infiltrados de células T B7.1/CD80 CD28+CD25+ e inmunidad (Cayeux y col., 1995).

Hasta ahora no hubo éxito terapéutico alguno, tampoco en el modelo de ratón.

Adicionalmente se ha observado en ensayos para la estimulación de respuestas inmunes mediante terapia génica con ADN de plásmido o secuencias de oligonucleótidos, que determinadas secuencias de ácido nucleico, que presentan el motivo CpG (CpG = dinucleótido citosina-guanosina no metilado), pueden tener un enorme efecto inmunoestimulador (Schmidt-Wolf y col., 1989, J. Immunol. Methods 125: 185-189). Las secuencias de ácido nucleico inmunoestimuladoras (ISS) se han usado ya desde muy pronto por este motivo como adyuvantes en protocolos de inmunización basados en ADN frente a agentes patógenos infecciosos (Sato y col., 1996, Science 273: 352-354). En experimentos con ratón se demostró que la administración de secuencias de ADN ricas en CpG conduce a una fuerte activación de las células B y estimula la expresión de determinadas citoquinas, por ejemplo, de IL-6 y GM-CSF. Igualmente se pudo demostrar en el modelo de ratón que una inmunización con CpG-oligodesoxirribonucleótidos (ODN) junto con una proteína de fusión pudo impedir tres días antes de la inoculación del tumor un crecimiento del tumor en el ratón (Liu y col., 1998). La indicación de consumo y preparación de ISS que contiene gen Cp inmunoestimulador se incluye en el documento WO 98/18810.

Del documento WO 00/04918 se sabe transfectar células tumorales con genes que codifican, por ejemplo, interferonagamma y GM-CSF. Como vectores de expresión se usan plásmidos. Este documento muestra un concepto, tratar enfermedades tumorales por inmunoterapia. No se muestran datos o resultados clínicos in-vivo o in-vitro de gran valor informativo que confirmen la actividad de las vacunas reivindicadas. Es de resaltar que estos vectores basados en plásmidos son adecuados para una aplicación en la terapia génica humana sin restricción, ya que además de las secuencias terapéuticas llevan las unidades de función genética que se necesitan para su replicación. Además presentan genes resistentes a antibióticos que son imprescindibles para su selección. Se realiza por tanto una expresión duradera terapéutica de proteínas no deseadas de mamíferos o de bacterias.

A pesar de las investigaciones a lo largo de muchos años y de enfoques prometedores no se ha conseguido hasta ahora el desarrollo de una terapia basada en inmunización efectiva contra enfermedades tumorales mediante la aplicación de sustancias inmunogénicas.

Es objetivo de la invención proporcionar una vacuna como medicamento para el tratamiento de enfermedades que se dan en relación con citoquinas como, por ejemplo, enfermedades cancerígenas, que se pueda usar específica y eficientemente y de forma particular conduzcan a la inducción de respuestas inmunes específicas del tumor. Además se debe preparar un procedimiento correspondiente para la... [Seguir leyendo]

1. Vacuna para el tratamiento de pacientes con enfermedades tumorales, que contiene células tumorales alógenas y oligodesoxirribonucleótidos inmunomoduladores como adyuvante, en donde se transfectaron las células tumorales en primer lugar ex-vivo con moléculas de ácido nucleico que codifican interleuquina-7 (IL-7), factor estimulador de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF), CD40L/CD154 y B7.1/CD80.

2. Vacuna para el tratamiento de pacientes con enfermedades tumorales, que contiene células tumorales alógenas y oligodesoxirribonucleótidos inmunomoduladores como adyuvante, en donde se transfectaron las células tumorales en primer lugar ex-vivo con moléculas de ácido nucleico que codifican interleuquina-7 (IL-7), factor estimulador de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF) y CD40L/CD154.

3. Vacuna según la reivindicación 1 ó 2, en donde las moléculas de ácido nucleico de codificación están presentes en una

o varias construcciones de expresión.

4. Vacuna según la reivindicación 3, en donde la construcción de expresión

a) es un plásmido, o

b) es un casete de expresión cerrado covalente, de doble hebra lineal, que se compone solamente de un promotor de CMV, de un intrón, de la secuencia génica de codificación y de una secuencia de poliadenilación, que está cerrado covalentemente en ambos extremos de la doble hebra mediante un bucle corto de restos de nucleótidos de hebra única.

5. Vacuna según una o varias de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el oligodesoxrribonucleótido inmunomodulador

a) comprende una secuencia con la sucesión de bases N1N2CGN3N4, siendo N1N2 un elemento seleccionado del grupo que comprende GT, GG, GA, AT o AA, N3N4 un elemento seleccionado del grupo que comprende CT o TT, así como C dexosicitosina, G desoxiguanosina, A desoxiadenosina y T desoxitimidina,

b) y una hebra circular comprende ácido desoxirribonucleico con una secuencia de bases antiparalela parcialmente complementarias entre sí, y está configurada en forma de haltera.

6. Vacuna según la reivindicación 5, en donde la secuencia con la sucesión de bases N1N2CGN3N4 está posicionada en la región de hebra única del oligodesoxirribonucleótido y comprende de 40 a 200 nucleótidos.

7. Vacuna según una o varias de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende un vehículo farmacéuticamente compatible.

8. Vacuna según la reivindicación 1 ó 2, en donde las células tumorales alógenas se seleccionan de carcinoma colorrectal, carcinoma de pulmón de células pequeñas y no pequeñas, carcinoma de próstata, carcinoma de mama, carcinoma de ovarios y carcinoma de células renales así como de melanoma maligno.

9. Vacuna según una o varias de las reivindicaciones 1 a 8, en donde las células tumorales proceden de la línea celular del carcinoma de riñón, que está depositada con el número DSM ACC 2635 en la DSMZ.

10. Procedimiento para la preparación de una vacuna según las reivindicaciones 1 a 8 para el tratamiento de pacientes con enfermedades tumorales, en donde se transfectan células tumorales alógenas ex vivo con moléculas de ácido nucleico que codifican

a) interleuquina-7 (IL-7), factor estimulador de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF), CD40L/CD154 y B7.1/CD80 o

b) interleuquina-7 (IL-7), factor estimulador de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF) y CD40L/CD154

y a continuación se añaden oligodesoxirribonucleótidos inmunomoduladores como adyuvante y a continuación se realiza la transmisión en una composición farmacéutica que se pueda administrar.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en donde el oligodesoxirribonucleótido inmunomodulador comprende un ácido desoxirribonucleico de hebra circular con una secuencia de bases antiparalela parcialmente complementaria entre sí, y está configurada en forma de haltera.

12. Procedimiento según la reivindicación 10 u 11, en donde el oligodesoxirribonucleótido inmunomodulador comprende una secuencia con la sucesión de bases N1N2CGN3N4, siendo N1N2 un elemento seleccionado del grupo que comprende GT, GG, GA, AT o AA, N3N4 un elemento seleccionado del grupo que comprende CT o TT, así como C dexosicitosina, G desoxiguanosina, A desoxiadenosina y T desoxitimidina,

13. Procedimiento según la reivindicación 12, estando posicionada la secuencia con la sucesión de bases N1N2CGN3N4

en la región de una hebra del oligodesoxirribonucleótido y comprende de 40 a 200 nucleótidos.

14. Procedimiento según la reivindicación 10, en donde la molécula de ácido nucleico está presente en una o varias construcciones de expresión.

15. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 10 a 14, caracterizado porque la transfección se realiza mediante transferencia balística, transfección de policationes, precipitación con fosfato de calcio, microinyección, fusión de protoplastos, fusión de liposomas, sistemas de transfección víricos, lipofección y/o electroporación.

16. Procedimiento según la reivindicación 10, en donde las células tumorales alógenas se seleccionan de carcinoma colorrectal, carcinoma de pulmón de células pequeñas y no pequeñas, carcinoma de próstata, carcinoma de mama, carcinoma de ovarios y carcinoma de células de riñón así como de melanoma maligno.

17. Procedimiento según la reivindicación 10, en donde las células tumorales proceden de varios pacientes con el mismo cuadro de enfermedad.

18. Procedimiento según una de las reivindicaciones 10 a 17, en donde se usan células tumorales de la línea celular del carcinoma de riñón que está depositada con el número DSM ACC 2635 en la DSMZ.

19. Célula tumoral humana que se transfectó ex vivo con moléculas de ácido nucleico que codifican

a) interleuquina-7 (IL-7), factor estimulador de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF), CD40L/CD154 y B7.1/CD80 para o b) interleuquina-7 (IL-7), factor estimulador de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF) y CD40L/CD154 y presenta construcciones de expresión correspondientes.

20. Célula tumoral humana según la reivindicación 19, en donde la construcción de expresión

a) es un plásmido, o

b) es un casete de expresión cerrado covalente, de doble hebra lineal, que se compone solamente de un promotor de CMV, de un intrón, de la secuencia génica de codificación y de una secuencia de poliadenilación, que está cerrado covalentemente en ambos extremos de la doble hebra mediante un bucle corto de restos de nucleótidos de hebra única.

21. Célula tumoral humana según las reivindicaciones 19 y 20, que se trata de una célula tumoral alógena de una línea celular del carcinoma de células renales.

22. Célula tumoral humana según la reivindicación 21, que se trata de células tumorales de la línea celular del carcinoma de células renales, que está depositada con el número DSM ACC 2635 en la DSMZ.

23. Célula tumoral humana según una o varias de las reivindicaciones 19 a 22 para uso como vacuna para el tratamiento de enfermedades tumorales.