MOLÉCULAS DE UNIÓN QUE PUEDEN NEUTRALIZAR EL VIRUS DE LA RABIA Y USOS DE LAS MISMAS.

Molécula de unión que tiene actividad neutralizante contra el virus de la rabia,

caracterizada por que la molécula de unión comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63, o una región variable de cadena pesada y ligera que tiene al menos un 80% de homología de secuencia con las mismas y en la que uno o más aminoácidos están alterados en comparación con la SEQ ID NO: 39 y la SEQ ID NO: 63 y que puede competir para unirse específicamente al virus de la rabia o a un fragmento del mismo con la molécula de unión que comprende la SEQ ID NO: 39 y la SEQ ID NO: 63, y que todavía tiene actividad neutralizante contra el virus de la rabia

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2005/052410.

Solicitante: CRUCELL HOLLAND B.V..

Nacionalidad solicitante: Países Bajos.

Dirección: ARCHIMEDESWEG 4 2333 CN LEIDEN PAISES BAJOS.

Inventor/es: DE KRUIF, CORNELIS, ADRIAAN, BAKKER,ALEXANDER,BERTHOLD,HENDRIK, MARISSEN,Willem Egbert, KRAMER,Robert Arjen.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 26 de Mayo de 2005.

Clasificación PCT:

  • A61K39/395 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 39/00 Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53). › Anticuerpos (aglutininas A61K 38/36 ); Inmunoglobulinas; Inmunosuero, p. ej. suero antilinfocitario.
  • A61P31/14 A61 […] › A61P ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS O DE PREPARACIONES MEDICINALES.A61P 31/00 Antiinfecciosos, es decir antibióticos, antisépticos, quimioterápicos. › para virus ARN.
  • C07K16/10 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 16/00 Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales. › de virus ARN.
  • C12N15/13 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Inmunoglobulinas.
  • C12N15/63 C12N 15/00 […] › Introducción de material genético extraño utilizando vectores; Vectores; Utilización de huéspedes para ello; Regulación de la expresión.
  • C12N5/10 C12N […] › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus.

Clasificación antigua:

  • A61K39/395 A61K 39/00 […] › Anticuerpos (aglutininas A61K 38/36 ); Inmunoglobulinas; Inmunosuero, p. ej. suero antilinfocitario.
  • A61P31/14 A61P 31/00 […] › para virus ARN.
  • C07K16/10 C07K 16/00 […] › de virus ARN.
  • C12N15/13 C12N 15/00 […] › Inmunoglobulinas.
  • C12N15/63 C12N 15/00 […] › Introducción de material genético extraño utilizando vectores; Vectores; Utilización de huéspedes para ello; Regulación de la expresión.
  • C12N5/10 C12N 5/00 […] › Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus.

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.

PDF original: ES-2362669_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a la medicina. En particular, la invención se refiere a moléculas de unión que neutralizan el virus de la rabia. Las moléculas de unión son útiles en la profilaxis tras la exposición de la rabia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La rabia es una infección viral con distribución casi mundial que afecta principalmente a animales salvajes y domésticos pero que también implica a seres humanos, dando como resultado una encefalitis devastadora, letal de manera casi invariable. Anualmente, se estiman más de 70.000 víctimas mortales humanas, y millones de otras personas requieren tratamiento tras la exposición.

El virus de la rabia es un virus de ARN monocatenario, con envuelta, con forma de bala, clasificado en la familia de los Rhabdovirus y del género Lyssavirus. El genoma del virus de la rabia codifica para cinco proteínas virales: ARN polimerasa dependiente de ARN (L); una nucleoproteína (N); una proteína fosforilada (P); una proteína de matriz (M) ubicada en el lado interno de la envuelta proteica viral; y una glicoproteína de superficie externa (G).

La proteína G (62-67 KDa) es una glicoproteína de tipo I compuesta por 505 aminoácidos que tiene de dos a cuatro posibles sitios de N-glicosilación, de los cuales solamente uno o dos se glicosilan dependiendo de las cepas del virus. La proteína G forma los salientes que cubren la superficie externa de la envuelta del virión y se sabe que induce anticuerpos que neutralizan el virus.

La rabia puede tratarse o prevenirse mediante inmunizaciones tanto pasivas como activas. La profilaxis tras la exposición a la rabia incluye el cuidado inmediato de la herida local y la administración de inmunizaciones tanto pasivas (inmunoglobulinas anti-rabia) como activas (vacunas).

Actualmente, las inmunoglobulinas anti-rabia (RIG) se preparan a partir de las muestras de suero de o bien seres humanos inmunizados contra el virus de la rabia (HRIG) o bien caballos inmunizados contra el virus de la rabia (ERIG). Una desventaja de ERIG así como de HRIG es que no están disponibles en cantidades suficientes y, en el caso de HRIG, es demasiado cara. Además, el uso de ERIG puede conducir a reacciones adversas tales como choque anafiláctico. La posibilidad de contaminación por patógenos conocidos o desconocidos es un problema adicional asociado con HRIG. Para superar estas desventajas se ha sugerido usar anticuerpos monoclonales que pueden neutralizar el virus de la rabia en profilaxis tras la exposición. Los anticuerpos monoclonales murinos que neutralizan el virus de la rabia se conocen en la técnica (véase Schumacher et al., 1989). Sin embargo, el uso de anticuerpos murinos in vivo está limitado debido a problemas asociados con la administración de anticuerpos murinos a seres humanos, tales como vida media en suero corta, una incapacidad para provocar ciertas funciones efectoras humanas y producción de una respuesta inmunitaria drástica no deseada contra el anticuerpo murino en un ser humano (la reacción de “anticuerpo humano anti-ratón” (HAMA)).

Recientemente, se han descrito anticuerpos monoclonales humanos que neutralizan el virus de la rabia (véase Dietzschold et al., 1990, Champion et al., 2000, y Hanlon et al., 2001). Para que los anticuerpos monoclonales humanos anti-rabia sean tan eficaces como HRIG en la profilaxis tras la exposición debe usarse una mezcla de anticuerpos monoclonales. En una mezcla de este tipo cada anticuerpo debe unirse a un epítopo o sitio diferente en el virus para prevenir el escape de variantes resistentes del virus.

Actualmente, todavía existe una necesidad significativa de nuevos anticuerpos monoclonales humanos que neutralizan el virus de la rabia que tengan potencial profiláctico tras la exposición mejorado, particularmente anticuerpos que tengan diferentes especificidades de reconocimiento de epítopo. La presente invención proporciona tales anticuerpos monoclonales humanos que ofrecen la posibilidad de usarse en mezclas útiles en la profilaxis tras la exposición de una amplia variedad de virus de la rabia y variantes resistentes a la neutralización de los mismos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La figura 1 muestra la comparación de las secuencias de aminoácidos de la cepa CVS-11 del virus de la rabia y los virus de escape E57. Se recogieron células infectadas por el virus 2 días tras la infección y se aisló el ARN total. Se generó ADNc y se usó para la secuenciación del ADN. Se muestran las regiones que contienen mutaciones y las mutaciones se indican en negrita. La figura 1A muestra la comparación de las secuencias de nucleótidos. Los números por encima de los aminoácidos indican los números de aminoácidos de la glicoproteína del virus de la rabia incluyendo el péptido señal. La figura 1B muestra la comparación de las secuencias de aminoácidos. En la parte superior se muestra la representación esquemática de la glicoproteína del virus de la rabia. El recuadro negro indica el péptido señal, mientras que el recuadro gris indica el dominio transmembrana. Las secuencias en la figura 1 también están representadas por las SEQ ID No: 130-141.

La figura 2 muestra la comparación de las secuencias de aminoácidos de la cepa CVS-11 del virus de la rabia y los virus de escape EJB. Se recogieron células infectadas por el virus 2 días tras la infección y se aisló el ARN total. Se generó ADNc y se usó para la secuenciación del ADN. Se muestran las regiones que contienen mutaciones y las mutaciones se indican en negrita. La figura 2A muestra la comparación de las secuencias de nucleótidos. Los números por encima de los aminoácidos indican los números de aminoácidos de la glicoproteína del virus de la rabia incluyendo el péptido señal. La figura 2B muestra la comparación de las secuencias de aminoácidos. En la parte superior se muestra la representación esquemática de la glicoproteína del virus de la rabia. El recuadro negro indica el péptido señal, mientras que el recuadro gris indica el dominio transmembrana. Las secuencias en la figura 2 también están representadas por las SEQ ID No: 142-151.

La figura 3 muestra el vector PDV-C06.

La figura 4 muestra un ELISA de competición de scFv anti-virus de la rabia y anticuerpo biotilinado anti-virus de la rabia denominado CR-57. Las placas de ELISA recubiertas con proteína G purificada del virus de la rabia se incubaron con scFv respectivos antes de la adición de CR-57bio (0,5 g/ml). Posteriormente, se monitorizó la unión de CR-57bio en ausencia y presencia de scFv.

La figura 5 muestra un ELISA de competición de scFv anti-virus de la rabia y anticuerpo anti-virus de la rabia denominado CR-57. Las placas de ELISA recubiertas con proteína G purificada del virus de la rabia se incubaron con CR-57 (1 g/ml) antes de la adición de scFv en exceso. Posteriormente, se monitorizó la unión de svFv en ausencia y presencia de CR-57.

La figura 6 muestra un ensayo de ELISA de competición de IgG anti-proteína G del virus de la rabia y el anticuerpo anti-virus de la rabia denominado CR-57. Se incubó proteína G (cepa ERA) con IgG no marcadas (mostrado en el eje X). Se añadió CR57 biotinilado (CR57bio) y se permitió que se uniera a la proteína G antes de visualización por medio del estreptavidina-HRP. Las señales de ELISA se muestran como porcentaje de unión de CR57bio solo.

La figura 7 muestra un ensayo de FACS de competición de IgG anti-proteína G del virus de la rabia y el anticuerpo anti-virus de la rabia denominado CR-57. Se incubaron células PER.C6 que expresan proteína G (cepa ERA) con IgG no marcadas (mostrado en el eje X). Se añadió CR57 biotinilado (CR57bio) y se permitió que se uniera a las células que expresan la proteína G antes de visualización por medio de estreptavidina-PE. Las señales de FACS se muestran como porcentaje de unión de CR57bio solo.

La figura 8 muestra la comparación de las secuencias de aminoácidos de virus de escape E98 y CVS-11. Se recogieron células infectadas por el virus 2 días tras la infección y se aisló el ARN total. Se generó ADNc y se usó para la secuenciación del ADN. Se muestra la región que contiene una mutación puntual y la mutación se indica en negrita. La figura 8A muestra la comparación de las secuencias de nucleótidos. El número por encima del nucleótido indica el nucleótido mutado (indicado en negrita) del marco de lectura abierto de la glicoproteína del virus de la rabia sin secuencia de péptido... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Molécula de unión que tiene actividad neutralizante contra el virus de la rabia, caracterizada por que la molécula de unión comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63, o una región variable de cadena pesada y ligera que tiene al menos un 80% de homología de secuencia con las mismas y en la que uno o más aminoácidos están alterados en comparación con la SEQ ID NO: 39 y la SEQ ID NO: 63 y que puede competir para unirse específicamente al virus de la rabia o a un fragmento del mismo con la molécula de unión que comprende la SEQ ID NO: 39 y la SEQ ID NO: 63, y que todavía tiene actividad neutralizante contra el virus de la rabia.

2. Molécula de unión según la reivindicación 1, caracterizada por que la molécula de unión es humana.

3. Molécula de unión según la reivindicación 1 ó 2, siendo la molécula de unión una IgG.

4. Inmunoconjugado que comprende una molécula de unión según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, comprendiendo el inmunoconjugado además al menos un agente terapéutico y/o agente detectable.

5. Molécula de ácido nucleico que codifica para una molécula de unión de según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

6. Vector que comprende al menos una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 5.

7. Célula huésped que comprende al menos un vector según la reivindicación 6.

8. Célula huésped según la reivindicación 7, que es una célula humana.

9. Método de producción de una molécula de unión según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, comprendiendo el método las etapas de:

a) cultivar una célula huésped según la reivindicación 7 u 8 en condiciones que conducen a la expresión de la molécula de unión, y opcionalmente,

b) recuperar la molécula de unión expresada.

10. Composición farmacéutica que comprende una molécula de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, comprendiendo además la composición farmacéutica al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

11. Composición farmacéutica según la reivindicación 10, que comprende al menos una molécula de unión adicional, que tiene actividad neutralizante contra el virus de la rabia y que se une a un epítopo diferente, no competitivo del virus de la rabia.

12. Composición farmacéutica según la reivindicación 11, caracterizada por que la molécula de unión adicional comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 273 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 275.

13. Molécula de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, inmunoconjugado según la reivindicación 4, o composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 10-12 para su uso como un medicamento.

14. Molécula de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, inmunoconjugado según la reivindicación 4, o composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 10-12, para su uso en la profilaxis o para su uso en el tratamiento, o combinación de los mismos, de la rabia.

15. Kit que comprende al menos una molécula de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, un inmunoconjugado según la reivindicación 4, o una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 10-12, o una combinación de los mismos.

 

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