MÉTODOS PARA OBTENER CÉLULAS INMORTALIZADAS QUE SECRETAN ANTICUERPOS.

Métodos para obtener células inmortalizadas que secretan anticuerpos Campo de la técnica La presente invención se relaciona con métodos para obtener células inmortalizadas que secreten anticuerpos, en particular aquellos de origen humano y que secreten anticuerpos que tengan alta especificidad por antígenos de interés médico. Antecedentes de la invención ES 2 367 322 T3 Los anticuerpos son proteínas de origen natural producidos por el sistema inmunológico con el propósito de combatir infecciones y eliminar factores patogénicos. Los anticuerpos ejercen sus funciones por medio del enlazamiento de antígenos proteicos o no proteicos y la activación de una respuesta defensiva para eliminarlos. En años recientes, se ha construido un enfoque terapéutico completo (llamado inmunoterapia pasiva o seroterapia pasiva) con base en las características de enlazamiento del antígeno de anticuerpos dirigidos tanto contra moléculas humanas como no humanas. La inmunoterapia pasiva consiste en la administración de composiciones farmacéuticas que contienen los anticuerpos terapéuticos con una especificidad definida del antígeno por una molécula patogénica (una toxina, una proteína, un virus, un parásito, o una célula, por ejemplo) a pacientes cuyo sistema inmune es incapaz de producirlos en las cantidades y/o con la especificidad requerida para bloquear y/o eliminar al patógeno (Dunman P. M. y Nesin M, 2003; Keller M. A. y Stiehm E. R., 2000). Este enfoque ha sido exitosamente introducido en la práctica clínica a comienzos de los 1980, y desde entonces el uso de anticuerpos terapéuticos ha extendido rápidamente las oportunidades para el tratamiento de una amplia variedad de enfermedades, incluidas enfermedades infecciosas, enfermedades mediadas por el sistema inmunológico y cáncer, dando como resultado un crecimiento constante del sector de anticuerpos monoclonales terapéuticos (Chatenoud L, 2005; Pavlou A y Belsey M, 2005; Laffy E y Sodoyer R, 2005). Los anticuerpos adecuados para inmunoterapia pasiva son aquellos que tienen actividad y especificidad homogéneas bien definidas. Estas propiedades pueden determinarse en forma más precisa y confiable para un anticuerpo monoclonal (es decir, un anticuerpo secretado por un solo clon de células secretoras de anticuerpos) que para un anticuerpo policlonal (es decir, una mezcla compleja de anticuerpos secretada por clones diferentes de células secretoras de anticuerpos). Desde los años 1970, se han desarrollado diferentes tecnologías para aislar, propagar, y mantener grandes grupos de líneas de células, cada uno derivado de un cultivo único de células monoclonales que secretan un anticuerpo monoclonal (mAb), que es analizado utilizando los ensayos apropiados, para identificar aquellos que tengan las propiedades deseadas. Dos importantes problemas técnicos son comunes para todos estos métodos: a) Cómo proveer el anticuerpo en las cantidades suficientes para los ensayos funcionales que se requieren para identificar y caracterizar el anticuerpo antes de realizar cualquier experimentación in vivo; b) Cómo garantizar que el anticuerpo terapéutico no sea reconocido en sí mismo como un antígeno por parte del sistema inmunológico del paciente, activando la eliminación del anticuerpo terapéutico y/o las reacciones inflamatorias inmunológicas que puedan ser nocivas para el paciente. El primer problema está relacionado con la dificultad en la propagación y el mantenimiento de células que secreten anticuerpo natural en cultivo durante el tiempo suficiente para tener el material biológico para analizar. Éste inconveniente ha sido resuelto ya sea por medio de inmortalización y manteniendo en cultivo de células que secreten anticuerpo primario en las cuales los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos han sido inicialmente generados y expresados, o por medio del uso de técnicas de ADN recombinante para el aislamiento de ácidos nucleicos que codifican al anticuerpo a partir de estas células y transferirlos dentro de células inmortalizadas, en las cuales pueden ser expresados y mantenidos. En el pasado, las células que secretan anticuerpo primario han sido inmortalizadas en condiciones de cultivo de células ya sea fusionándolas con células ya inmortalizadas (formando células híbridas o hibridomas que pueden ser más fácilmente mantenidos), o por medio del uso de agentes (tales como virus) que alteran la maquinaria celular de las células que secretan anticuerpo primario de tal manera que las células se propagan casi indefinidamente. El problema de garantizar la seguridad del paciente ha sido resuelto en el pasado ya sea haciendo uso de células y de ácidos nucleicos de origen humano para la producción de anticuerpos, o por medio de la modificación de los 2 ES 2 367 322 T3 genes que codifican anticuerpos no humanos, que tienen un potencial inmunogénico, con secuencia de origen humano, un proceso de "humanización" llevado a cabo utilizando tecnologías de ADN recombinante. En conclusión, la inmunoterapia pasiva puede conferir una protección rápida y eficiente contra infecciones y otras patologías. Sin embargo, cada método para aislar, seleccionar, y producir anticuerpos monoclonales completamente compatibles con el tratamiento en humanos que sufran de un tipo diferente de inconveniente, como se reseña brevemente a continuación. La tecnología de hibridoma, descrita por primera vez por Kohler y Milstein (Kohler G y Milstein C, 1975), permitió el aislamiento de clones en continuo crecimiento de células que secretan anticuerpo después de ser fusionadas con un tipo apropiado de célula inmortalizada. Se han derivado hibridomas a partir de células humanas que secretan anticuerpo (Olsson L y Kaplan H, 1980), pero el proceso para producir hibridomas humanos no ha demostrado ser sólido, de debido a la carencia de mieloma humano adecuado o de compañeros de fusión linfoblastoides, y a la inestabilidad de homohibridomas de humano/humano y heterohibridomas de humano/múrido. En la humanización de anticuerpos de múrido puede ser lograda injertando la región de enlazamiento del antígeno del anticuerpo monoclonal de múrido sobre la columna vertebral de una molécula de anticuerpo humano, produciendo una molécula quimérica, y por medio de la sustitución de residuos específicos de múrido con otros aminoácidos humanos para reducir la antigenicidad a través de enfoques moleculares (Hwang W y Foote J, 2005; Carter P, 2006). Existen numerosos anticuerpos "humanizados" actualmente en uso o en ensayos clínicos. Sin embargo, estos anticuerpos contienen aún 5 - 10% de secuencias de proteína de múrido (o no completamente humana) y pueden provocar una respuesta inmune que limita la eficacia terapéutica de estos fármacos. Además, el proceso de inmunización es laborioso y algunas veces resultan cambios para el enlazamiento del anticuerpo. Por lo tanto, este método ha sido utilizado principalmente con células que secretan anticuerpo originadas en roedores inmunizados con el antígeno relevante. Teniendo en cuenta que las secuencias de origen múrido pueden ser inmunogénicas en humanos, los mAb resultantes pueden provocar respuestas tóxicas anti-múrido de humano, que tienen una citotoxicidad celular que depende del anticuerpo afectado, y/o son rápidamente eliminadas del organismo. Además, incluso anticuerpos con idéntica región variable pueden presentar diferentes propiedades inmunogénicas y funcionales (Torres M et al., 2005). Los enfoques principales para producir anticuerpos monoclonales completamente humanos se basan en la clonación y la expresión de genes para la inmunoglobulina humana utilizando tecnologías de ADN recombinante. En un primer caso, se pueden amplificar bibliotecas de secuencias de ADN que codifican fragmentos de anticuerpo, incluidas regiones de enlazamiento de antígeno, a partir de tejidos humanos e insertarlas dentro de un fago bacteriano, permitiendo el "despliegue" de fragmentos de enlazamiento de antígeno sobre la superficie del fago y la posterior selección. Se han producido anticuerpos monoclonales contra patógenos humanos, partiendo del gran repertorio de anticuerpos derivados de los pacientes que fue clonando y seleccionado utilizando tecnologías de despliegue en fagos (Mancini N et al., 2004). Sin embargo, como se emplea bajo la mayoría de las circunstancias, estas bibliotecas pueden ser ineficaces para identificar anticuerpos terapéuticos ya que los genes para el anticuerpo no son seleccionados como el sistema inmunológico lo hace in vivo, por un lado, para la eliminación de las secuencias en el repertorio de anticuerpos humanos que pueden provocar una respuesta inmune, y, por otro lado, para seleccionar secuencias de anticuerpo resultantes de la maduración por afinidad. En consecuencia, la maduración compleja de la afinidad in vitro y otras tecnologías que permiten alteraciones... [Seguir leyendo]

1. Un método para inmortalización de una población de células que secreta anticuerpos de uno o más isotipos específicos que comprende las siguientes etapas en secuencia: a) Seleccionar la población de células que expresa anticuerpos a partir de una o más muestras biológicas en una forma independiente del antígeno y sobre la base de la expresión de al menos un marcador de la superficie de la célula; b) Estimular dicha población de células seleccionadas con al menos un agente de estimulación en condiciones de cultivo de células; c) Eliminar dicho agente de estimulación del cultivo de células; d) Seleccionar la población de células estimulada que expresa anticuerpos de uno o más isotipos a partir de dicho cultivo de células; e) Exponer dicha población de células seleccionadas y estimuladas al agente de inmortalización en las condiciones de cultivo de células; f) Eliminar dicho agente de inmortalización de dicho cultivo de células; En donde el agente de inmortalización es un agente de inmortalización del tipo viral. 2. Un método de la reivindicación 1, en donde dicha población de células de la etapa (a) son células B humanas y el marcador de la superficie de la célula es CD22, CD19, o CD27. 3. Un método de la reivindicación 1 ó 2, en donde dicho agente estimulador se escoge entre: a) Una combinación de un oligonucleótido con base en CpG y una citoquina; b) Una combinación de un agonista de un receptor de la membrana celular de la familia del receptor TNF y una citoquina; Y el agente de inmortalización viral es el virus de Epstein-Barr. 4. Un método de cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 3, en donde la población de células de la etapa d) expresa anticuerpos IgG. 5. Una población de células obtenida por medio de un método de cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4. 6. Un cultivo de células que contiene una población de células de la reivindicación 5. 7. El uso de una población de células de la reivindicación 5, o de un cultivo de células de la reivindicación 6, para identificar y producir un anticuerpo monoclonal que tenga la especificidad de enlazamiento con el antígeno y/o la actividad biológica deseados. 8. El uso de cultivos de células de una población de células de la reivindicación 5, o de un cultivo de células de la reivindicación 6, que se obtienen de las células que secretan anticuerpo suministradas por un individuo para determinar las características de la respuesta inmune, específica del isotipo a un antígeno autólogo o heterólogo, un virus, una célula bacteriana, una toxina, una célula parásita, o una vacuna en dicho individuo. 9. Un kit para identificar y producir un anticuerpo monoclonal que tenga la especificidad de enlazamiento con el antígeno y/o la actividad biológica deseados, en donde dicho kit contiene una población de células de la reivindicación 5, o un cultivo de células de la reivindicación 6. 10. Un método para producir un cultivo de células que secreta un anticuerpo monoclonal que tenga la especificidad de enlazamiento con el antígeno y/o la actividad biológica deseados que comprende las siguientes etapas: a) Dividir una población de células obtenida por medio de un método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o un cultivo de células de la reivindicación 6 en cultivos de células que contengan cada uno 20 o más células; b) Seleccionar el sobrenadante de dichos cultivos de células para detectar aquellas que muestran la especificidad de enlazamiento con el antígeno y/o la actividad biológica deseados; c) Dividir los cultivos de células que muestren especificidad por el antígeno y/o la actividad biológica deseados en cultivos o poblaciones de células; d) Repetir las etapas (b) y (c) sobre dichos cultivos de células hasta aislar uno o más de los cultivos de células, que secretan cada uno un anticuerpo monoclonal que tiene la especificidad de enlazamiento con el antígeno, y/o la actividad biológica deseados en el sobrenadante de células. 11. Un método para producir un cultivo de células que secreta un anticuerpo monoclonal que tenga la especificidad de enlazamiento con el antígeno y/o la actividad biológica deseados que comprende las siguientes etapas: 43 ES 2 367 322 T3 a) Seleccionar el sobrenadante de los cultivos de células obtenido dividiendo una población de células obtenida por medio de un método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o un cultivo de células de la reivindicación 6 en poblaciones múltiples de células que contengan 20 o más de tales células para detectar una o más de dichas poblaciones de células que secreten anticuerpos que tengan la especificidad por el antígeno y/o la actividad 5 biológica deseados; b) Determinar la secuencia del anticuerpo secretado por cada uno de los cultivos de células que muestran dicha actividad en el sobrenadante; c) Aislar los cultivos de células que secreten un anticuerpo monoclonal que tenga tal actividad. 10 12. Un método de acuerdo con la reivindicación 10 u 11 que comprende: a) La extensión de dicho cultivo de células; y b) Purificar el anticuerpo monoclonal del sobrenadante de dicho cultivo de células. 15 13. Un método de cualquiera de las reivindicaciones de 10 a 12, en donde la especificidad de enlazamiento con el antígeno y/o la actividad biológica deseados está dirigida a un antígeno humano, de mamífero, viral, bacteriano, de una planta, parasito, orgánico, o inorgánico. 44 Fig. 1 ES 2 367 322 T3 Análisis cualitativo de células que secretan anticuerpo (por ejemplo células B humanas) o muestras que contienen anticuerpo (por ejemplo, sueros) de donantes para identificar candidatos para seleccionar anticuerpos de interés (por ejemplo, neutralización y/o enlazamiento de un patógeno humano o un objetivo terapéutico) Obtener muestras de candidatos en cantidades suficientes para seleccionar las células que secretan anticuerpo (por ejemplo, 10 ml de sangre) Seleccionar células B haciendo uso de al menos un marcador de la superficie de la célula apropiado para estimulación e inmortalización adicionales (por ejemplo, CD22 y/o CD19) Estimular células B utilizando al menos un agente estimulador (por ejemplo, IL-2 y CpG2006) durante un período de tiempo apropiado para proliferación y viabilidad de las células (4 días) Eliminar el agente estimulador del cultivo de células a granel Seleccionar las células estimuladas del cultivo de células que expresa anticuerpos de los isotipos deseados (por ejemplo, células humanas negativas para IgM o positivas para IgG) Exponer dichas células seleccionadas y estimuladas al agente de inmortalización viral (por ejemplo EBV) Eliminar el agente de inmortalización viral del cultivo de células Mantener la población de células en condiciones de cultivo que permitan la proliferación de las células y la secreción de los anticuerpos (por ejemplo, haciendo posible confirmar la presencia del anticuerpo de interés en el sobrenadante del cultivo celular) Dividir el cultivo de células en grupos de células que se utilizan para preparar ya sea cultivos de células (por ejemplo, la siembra de 20 células o más por pozo) o viales para almacenar células en un estado congelado Seleccionar los sobrenadantes de estos cultivos de células para identificar aquellos que presenten la actividad funcional y/o de enlazamiento deseada Dividir los cultivos de células positivos y seleccionar los sobrenadantes de los cultivos de células resultantes Repetir el proceso de dividir y seleccionar cultivos de células hasta aislar uno o más cultivos de células monoclonales que secreten los anticuerpos deseados Expandir los cultivos de células monoclonales para purificar el anticuerpo secretado y/o aislar el ADN que codifica el anticuerpo secretado que puede ser producido utilizando tecnología de ADN recombinante en células huésped ES 2 367 322 T3 46 ES 2 367 322 T3 47 ES 2 367 322 T3 48 ES 2 367 322 T3 49 ES 2 367 322 T3 ES 2 367 322 T3 51 ES 2 367 322 T3 52 ES 2 367 322 T3 53 ES 2 367 322 T3 54 Fig. 11 ES 2 367 322 T3 Aislamiento de PBMC humanas a partir de sangre periférica de donantes (seropositivos para citomegalovirus humano en ELISA, ELISPOT, y/o ensayos de neutralización) utilizando el procedimiento Ficoll/Hypaque Selección de células B positivas para CD22, o positivas para CD22 y positivas para CD27 a partir de PBMC congeladas o frescas utilizando microesferas magnéticas Estimulación de células B utilizando CpG2006 (1 g/ml) + IL-2 (1000 U/ml) para el medio de cultivo celular (RPMI complementado con Suero de Ternera Fetal al 10%) durante 2 - 4 días Lavado de células B estimuladas con el medio de cultivo celular Selección de células B que expresan IgG por medio de selección negativa o positiva, utilizando clasificación de células ya sea con base negativa para IgM o positiva para IgG o sistemas de separación con esferas magnéticas Exposición del cultivo policlonal a granel de células B estimuladas que expresan IgG al sobrenadante de EBV al 50% V/V en el medio de cultivo durante 4 - 12 horas Lavado del cultivo a granel con medio de cultivo fresco para células y mantener las células en el medio de cultivo para células con IL-2 (1000 U/ml) sobre PBMC alogénicas irradiadas durante 8 - 10 días Dividir el cultivo de células B estimuladas y seleccionadas en grupos de 50 - 100 células en placas de 96 pozos en medio de cultivo celular con IL-2 (1000 U/ml) sobre PBMC alogénicas irradiadas, con o sin estimulantes de crecimiento de células B (por ejemplo, CpG2006) durante 1 - 4 semanas Selección de los sobrenadantes de cada pozo para identificar aquellas que muestren actividad de neutralización del CMV y/o enlazamiento del CMV humano Subclonación y selección de cultivos de células positivas hasta aislar uno o más cultivos de células monoclonales que secretan anticuerpos IgG que tienen la actividad de neutralización del CMV y/o enlazamiento del CMV humano Expandir los cultivos de células monoclonales y determinar la secuencia de ADN que codifica para los anticuerpos específicos para CMV, para ser clonados y expresados como proteínas recombinantes utilizando vectores y células huésped apropiados ES 2 367 322 T3 56 ES 2 367 322 T3 57 ES 2 367 322 T3 58 ES 2 367 322 T3 59 REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN Este listado de referencias citado por el solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido. Documentos de patente citados en la descripción ES 2 367 322 T3 US 4997764 A [0027] [0053] US 5798230 A [0125] WO 9109115 A [0027] [0053] [0103] [0215] WO 91091115 A [0143] WO 04076677 A [0027] [0053] [0215] WO 0582926 A [0159] WO 8801642 A [0027] WO 05003379 A [0159] WO 9002795 A [0027] WO 0583064 A [0159] WO 9640252 A [0027] WO 0576013 A [0159] WO 0246233 A [0027] [0053] WO 0149713 A [0170] WO 0476677 A [0103] EP 2005056871 W [0272] WO 9424164 A [0103] [0143] Literatura citada en la descripción que no es de patente: Human B-cell responses to cytokines. Callard R ; Kotowicz K. Cytokine Cell Biology: A practical Approach. Oxford University Press, 2000, 17 - 31 [0091] [0099] Boehme K ; Compton T. Cytomegaloviruses. Molecular Biology and Immunology. Norfolk: Caister Academic Press, 2006, 111 - 130 [0255] Mach M. CYTMEGALOVIRUSES. MOLECULAR BIOLOGY AND IMMUNOLOGY. 265 - 283 [0255] Abel K et al. Clin Diagn Lab Immunol., 2005, vol. 12, 606 - 21 [0271] Akira S; Takeda K. Nat Rev Immunol., 2004, vol. 4, 499 - 511 [0271] Aldrich T. L. et al. Biotechnol Prog., 2003, vol. 19, 1433 - 8 [0271] Ambach A et al. Mol Immunol., 2004, vol. 40, 1307 - 14 [0271] Azim T; Crawford D. Int J Cancer., 1988, vol. 42, 23 - 8 [0271] Banchereau J ; Rousset, F. Adv Immunol., 1992, vol. 52, 125 - 262 [0271] Bason C et al. Lancet., 2003, vol. 362, 1971 - 7 [0271] Bass H ; Darke C. Cell Prolif., 2004, vol. 37, 443 - 4 [0271] Bernasconi N et al. Science, 2002, vol. 298, 2199 - 2202 [0271] Bernasconi N et al. Blood, 2003, vol. 101, 4500 - 4504 [0271] Bianchi A ; McGrew J. Biotechnol Bioeng., 2003, vol. 84, 439 - 44 [0271] Bishop G. A.; Busch LK. Microbes Infect., 2002, vol. 4, 853 - 7 [0271] Bohm E et al. Biotechnol Bioeng., 2004, vol. 88, 699 - 706 [0271] Bonaros NE et al. Transplantation, 2004, vol. 77, 890 - 7 [0271] Borrebaeck C et al. PNAS, 1988, vol. 85, 3995 - 9 [0271] Borrebaeck C. J Immunol Meth, 1989, vol. 123, 157 - 165 [0271] Borst J et al. Curr Opin Immunol., 2005, vol. 17, 275 - 81 [0271] Borth N. Biotechnol Bioeng, 2002, vol. 77, 118 [0271] Boyd A ; Fecondo J. Immunol Cell Biol., 2003, vol. 66, 159 - 165 [0271] Bourke E et al. Blood, 2003, vol. 102, 956 - 63 [0271] Bradbury A. et al. Trends Biotechnol., 2003, vol. 21, 275-81312-7 [0271] Bron D et al. PNAS, 1984, vol. 81, 3214 - 7 [0271] Butel J. Carcinogenesis, 2000, vol. 21, 405 - 26 [0271] Butler M. Appl Microbiol Biotechnol., 2005, vol. 68, 283 - 91 [0271] Carsetti R. Methods Mol Biol., 2004, vol. 271, 25 - 35 [0271] Carter P. Nat Rev Immunol., 2006, vol. 6, 343 - 57 [0271] Casali P et al. Science, 1986, vol. 234, 476 - 9 [0271] Chambers R. Curr Opin Chem Biol., 2005, vol. 9, 46 - 50 [0271] Chan M et al. J Immunol, 1986, vol. 136, 106 - 112 [0271] Chapman AP et al. Nat Biotechnol., 1999, vol. 17, 780 - 3 [0271] Chardes T et al. FEBS Lett., 1999, vol. 452, 386 - 94 [0271] Chatenoud L. Methods Mol Med., 2005, vol. 109, 297 - 328 [0271] Chen C et al. J Surg Res., 2001, vol. 100, 166 - 70 [0271] Chen K et al. Biotechnol Bioeng., 2001, vol. 72, 55 - 61 [0271] Coban C et al. J Exp Med., 2005, vol. 201, 19 - 25 [0271] Cognasse F. et al. Clin Chem Lab Med., 2005, vol. 43, 22 - 31 [0271] Cole S. Mol Cell Bioch, 1984, vol. 62, 109 - 120 [0271] Craxton A et al. Blood, 2003, vol. 101, 4464 - 71 [0271] Crotty S; Ahmed R. Semin Immunol., 2004, vol. 16, 197 - 203 [0271] Crotty S et al. J Immunol Meth, 2004, vol. 286, 111 - 122 [0271] ES 2 367 322 T3 Damania B. Nat Rev Microbiol., 2004, vol. 2, 656 - 68 [0271] Danczyk R et al. Biotechnol Bioeng., 2003, vol. 20 (84), 215 - 23 [0271] Dattamajumdar AK et al. Immunogenetics, 1996, vol. 43, 141 - 51 [0271] Davenport C et al. FEMS Microbiol Immunol., 1992, vol. 4, 335 - 43 [0271] Dessain SK et al. J Immunol Methods., 2004, vol. 291, 109 - 22 [0271] Dinnis D ; James D. Biotechnol Bioeng., 2005, vol. 91, 180 - 9 [0271] Dunman PM ; Nesin M. Curr Opin Pharmacol., 2003, vol. 3, 486 - 96 [0271] Eaton-Bassiri A et al. Infect Immun., 2004, vol. 72, 7202 - 11 [0271] Essono S et al. J Immunol Methods., 2003, vol. 279, 251 - 66 [0271] Evans L et al. J Immunol, 1988, vol. 140, 941 - 943 [0271] Fang J et al. Nat Biotechnol., 2005, vol. 23, 584 - 90 [0271] Fearon D ; Carroll M. Ann Rev Immun., 2000, vol. 18, 393 - 422 [0271] Fearon K et al. Eur J Immunol, 2003, vol. 33, 2114 - 2122 [0271] Forthal D. N. et al. Transpl Infect Dis., 2001, vol. 3 (2), 31 - 4 [0271] Furebring C et al. Mol Immunol., 2002, vol. 38, 833 - 40 [0271] Gay, N. J. et al. Nat Rev Immunol., 2006, vol. 9, 693 - 698 [0271] Gilliland L. K. et al. Tissue Antigens., 1996, vol. 47, 1 - 20 [0271] Giudicelli, V. et al. Nucl. Acids Res., 2004, vol. 32, W435 - 440 [0271] Goodrum F. D. et al. PNAS, 2002, vol. 99, 16255 - 60 [0271] Gosselin J et al. J Immunol., 2005, vol. 174, 1587 - 93 [0271] Greijer A et al. J Clin Microbiol., 1999, vol. 37, 179 - 88 [0271] Grunberg J et al. Biotechniques, 2003, vol. 34, 968 - 72 [0271] Gursel I et al. J Immunol., 2001, vol. 167, 3324 - 8 [0271] Gursel M et al. J Leukoc Biol., 2002, vol. 71, 813 - 20 [0271] Haan K et al. J Virol., 2001, vol. 75, 3016 - 20 [0271] Haab B. B. Mol Cell Proteomics., 2005, vol. 4, 377 - 83 [0271] Hale G et al. Q J Nucl Med Mol Imaging., 2004, vol. 48, 258 - 66 [0271] Hartmann G et al. J Immunol, 2002, vol. 164, 1617 - 1624 [0271] Hartmann G ; Krieg A. J Immunol., 2000, vol. 164, 944 - 53 [0271] Hayashi E et al. J Immunol., 2005, vol. 174 (11), 6639 - 47 [0271] He B et al. J Immunol., 2004, vol. 172, 3268 - 79 [0271] Heinrichs A et al. J Immunol Methods., 1995, vol. 178, 241 - 51 [0271] Hemmi H et al. Nature, 2000, vol. 408, 740 - 5 [0271] Henault M et al. J Immunol Methods., 2005, vol. 300, 93 - 9 [0271] Hoet R et al. Nat Biotechnol, 2005, vol. 23, 344 - 348 [0271] Horenstein AL et al. J Immunol Methods, 2003, vol. 275, 99 - 112 [0271] Humme S. PNAS, 2003, vol. 100, 10989 - 94 [0271] Hur D et al. Cell Prolif., 2005, vol. 38, 35 - 45 [0271] Huse K et al. J Biochem Biophys Methods, 2002, vol. 51, 217 - 31 [0271] Hwang W ; Foote J. Methods, 2005, vol. 36, 3 - 10 [0271] Ifversen P et al. Hum Antibodies Hybridomas., 1993, vol. 4, 113 - 123 [0271] Imadome K et al. PNAS., 2003, vol. 100, 7836 - 40 [0271] James K ; Bell G. J Immunol Methods., 1987, vol. 100, 5 - 40 [0271] Jarrin A ; Andrieux A. Methods Mol Biol., 1999, vol. 96, 21 - 8 [0271] Jensen L. B. et al. J Immunol Methods., 2004, vol. 284, 45 - 54 [0271] Jondal M ; Klein G. J Exp Med, 1973, vol. 138, 1365 - 1378 [0271] Jovelin F et al. Biotechniques., 1995, vol. 1.9, 378 - 82 [0271] Jung J et al. J Immunol, 2002, vol. 169, 2368 - 2373 [0271] Kandimalla ER et al. PNAS., 2005, vol. 102, 6925 - 30 [0271] Keller M. A. ; Stiehm ER. Clin Microbiol Rev., 2000, vol. 13, 602 - 14 [0271] Kellermann S ; Green L. Curr Opin Biotechnol., 2002, vol. 13, 593 - 7 [0271] Kern F et al. Trends Immunol., 2005, vol. 26, 477 - 84 [0271] Kilger E et al. EMBO J., 1998, vol. 17, 1700 - 9 [0271] Kim S. J. et al. Mol Cells., 2005, vol. 20, 17 - 29 [0271] Klinman D et al. PNAS, 1996, vol. 93, 2879 - 2883 [0271] Klinman D. Nat Rev Immunol., 2004, vol. 4, 249 - 58 [0271] Kocher A. A. et al. J Heart Lung Transpl., 2003, vol. 22, 250 - 7 [0271] Kohler G ; Milstein C. Nature, 1975, vol. 256, 495 - 497 [0271] Konishi K. J Gen Virol., 2001, vol. 82, 1451 - 6 [0271] Kretzmer G. Appl Microbiol Biotechnol., 2002, vol. 59, 135 - 42 [0271] Krieg A et al. Nature, 1995, vol. 374, 546 - 9 [0271] Krieg A. Annu Rev Immunol., 2002, vol. 20, 709 - 60 [0271] Kruger R. M. et al. J Heart Lung Transpl., 2003, vol. 22, 754 - 63 [0271] Laffy E; Sodoyer R. Hum. Antibodies., 2005, vol. 14, 33 - 55 [0271] Lal SP et al. Drug Discov Today., 2002, vol. 7, 143 - 9 [0271] 61 ES 2 367 322 T3 Landolfo S et al. Pharmacol Ther., 2003, vol. 98, 269 - 97 [0271] Laquerre S et al. J Virol., 1998, vol. 72, 6119 - 30 [0271] Laroche-Traineau J et al. Hum Antib Hydrid., 1994, vol. 5, 165 - 177 [0271] Li H et al. Biochem Biophys Res Commun, 1995, vol. 207, 985 - 93 [0271] Li J et al. Proc Natl Acad Sci USA., 2006, vol. 103, 3557 - 62 [0271] Lightwood D et al. J Immunol Methods., 2006, vol. 316, 133 - 43 [0271] Ling N. J Immunol Methods., 2000, vol. 238, 3 - 15 [0271] Lobo E et al. J Pharm Sci., 2004, vol. 93, 2645 - 68 [0271] Ma J. K. et al. Vaccine., 2005, vol. 23, 1814 - 8 [0271] Mancini G et al. Immunochemistry., 1965, vol. 2, 235 - 254 [0271] Mancini N et al. New Microbiol., 2004, vol. 27, 315 - 28 [0271] McHeyzer-Williams L ; McHeyzer-Williams M. Annu Rev Immunol., 2005, vol. 23, 487 - 513 [0271] Mezzasoma L et al. Clin Chem., 2002, vol. 48, 121 - 30 [0271] Morgenthaler N et al. J. Clin Endocrinology., 1996, vol. 81, 3155 - 3161 [0271] Mulder A et al. Hum Immunol., 1993, vol. 36, 186 - 92 [0271] Murray A et al. J Chromatogr Sci., 2002, vol. 40, 343 - 9 [0271] Nemerow G et al. J Virol, 1985, vol. 55, 347 - 351 [0271] Nicholas J. Mol Pathol., 2000, vol. 53, 222 - 37 [0271] Niedbala W ; Kurpisz M. Immunol Lett., 1993, vol. 35, 93 - 100 [0271] Niedbala W ; Stott D. Hybridoma, 1998, vol. 17, 299 - 304 [0271] Nisnevitch M ; Firer M. A. J Biochem Biophys Methods., 2001, vol. 49, 467 - 80 [0271] Nitschke L. Curr Opin Immunol., 2005, vol. 17, 290 - 7 [0271] Norderhaug L et al. J Immunol Methods., 1997, vol. 204, 77 - 87 [0271] Oh H et al. Cell Prolif., 2003, vol. 36, 191 - 97 [0271] Ohlin M et al. J Virol., 1993, vol. 67, 703 - 10 [0271] Olivo P. Clin Microbiol Rev., 1996, vol. 9, 321 - 34 [0271] Olsson L ; Kaplan H. PNAS, 1980, vol. 77, 5429 - 5431 [0271] Park C. H. et al. J Cell Biochem., 2004, vol. 91, 777 - 85 [0271] Pavlou A ; Belsey M. Eur J Pharm Biopharm., 2005, vol. 59, 389 - 96 [0271] Peng S. Curr Opin Immunol., 2005, vol. 17, 230 - 6 [0271] Posner M et al. J Immunol., 1991, vol. 146, 4325 - 4332 [0271] Potera C. Genetic Eng News., 2005, vol. 25, 10, http://www.trellisbio.corn/article_GEN_051505.pdf [0271] Poul M. A. et al. Immunotechnology., 1995, vol. 1, 189 - 96 [0271] Radons J et al. J Immunol Methods., 2005, vol. 303, 135 - 41 [0271] Raff H et al. J Exp Med., 1988, vol. 168, 905 - 17 [0271] Ranjan D et al. Cell Biochem Funct., 2006, vol. 24, 147 - 152 [0271] Reinhardt B et al. J Virol Methods., 2003, vol. 109, 1 - 9 [0271] Rickinson A. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci., 2001, vol. 356, 595 - 604 [0271] Roque A. C. et al. Biotechnol Prog., 2004, vol. 20, 639 - 5 [0271] Schlatter S et al. Biotechnol Prog., 2005, vol. 21, 122 - 33 [0271] Schlee M et al. J Virol., 2004, vol. 78, 3941 - 52 [0271] Schmidt F. Appl Microbiol Biotechnol., 2004, vol. 65, 363 - 72 [0271] Schneider P. Curr Opin Immunol., 2005, vol. 17, 282 - 9 [0271] Schoppel K et al. Virology., 1996, vol. 216, 133 - 45 [0271] Sen G et al. Cell Immunol., 2004, vol. 232, 64 - 74 [0271] Sorensen H ; Mortensen K. J Biotech., 2005, vol. 115, 113 - 28 [0271] Speck P et al. J Gen Virol., 1999, vol. 80, 2193 - 203 [0271] Steenbakkers P et al. Hum Antibod Hybrid., 1993, vol. 4, 166 - 173 [0271] Steenbakkers P et al. Mol Biol Rep., 1994, vol. 19, 125 - 134 [0271] Sugimoto M et al. Cancer Res., 2004, vol. 64, 3361 - 4 [0271] Sun L et al. J Immunol. Methods., 2003, vol. 282, 45 - 52 [0271] Takeshita F et al. J Immunol., 2001, vol. 167, 3555 - 8 [0271] Tangye S et al. J Immunol., 2003, vol. 170, 261 - 9 [0271] Tanner J. E. ; Menezes J. Blood., 1994, vol. 84, 3956 - 64 [0271] Thomas T. M. et al. Hybrid Hybridomics., 2003, vol. 22, 47 - 53 [0271] Thomsen M et al. Tissue Antigens., 2005, vol. 66, 73 - 82 [0271] Thorley-Lawson D. A. Nat Rev Immunol., 2001, vol. 1 (1), 75 - 82 [0271] Torres M et al. J Immunol., 2005, vol. 174, 2132 - 42 [0271] Traggiai E et al. Nat Med, 2004, vol. 10, 871 - 875 [0271] Tsuchiyama L et al. Hum Antibodies., 1997, vol. 8, 43 - 7 [0271] Ulevitch R. Nat Rev Immun., 2004, vol. 4, 512 - 520 [0271] Venturi M et al. J Mol Biol, 2002, vol. 315, 1 - 8 [0271] Verdoliva A et al. J Immunol Methods., 2002, vol. 271, 77 - 8 [0271] Viau M ; Zouali M. Clin Immunol., 2005, vol. 114, 17 - 26 [0271] Wallis R et al. J Clin Invest, 1989, vol. 84, 214 - 219 [0271] 62 ES 2 367 322 T3 Wen et al. Eur J Immunol., 1987, vol. 17, 887 - 92 [0271] Wendel-Hansen V et al. Leukemia., 1994, vol. 8, 476 - 84 [0271] Wroblewski J et al. J Immunol Meth., 2002, vol. 264, 19 - 28 [0271] Yamaguchi H et al. PNAS, 1987, vol. 84, 2416 - 2420 [0271] Yoon SK et al. Biotechnol Prog., 2004, vol. 20, 1683 - 8 [0271] 63