MÉTODO Y COMPUESTO ANTIBACTERIANO ANTISENTIDO.

La presente invención se refiere a compuestos de oligonucleótidos que son antisentido para genes de bacteria y a métodos para usar dichos compuestos en la inhibición del crecimiento bacteriano, por ejemplo en un sujeto mamífero infectado, tal como se caracteriza en las reivindicaciones. Referencias Blommers, M. J., y col., Nucleic Acids Res 22(20): 4187-94, (1994). Bramhill, D., Annu Rev Cell Dev Biol 13: 395-424. Cross, C. W., y col., Biochemistry 36(14): 4096-107, (1997). Donachie, W. D., Annu Rev Microbiol 47: 199-230, (1993). Dryselius, R., y col., Oligonucleotides 13(6): 427-33, (2003). Frimodt-Moller, N., J., y col., HANDBOOK OF ANIMAL MODELS OF INFECTION., San Diego, CA, Academic Press, (1999). Gait, M. J., y col., J Chem Soc [Perkin 1] 0(14): 1684-6, (1974). Galloway, S. M. y Raetz, C.R., J Biol Chem 265(11): 6394-402, (1990). Geller, B. L., y col., Antimicrob Agents Chemother 47(10): 3233-9, (2003). Geller, B. L. y Green, H.M., J Biol Chem 264(28): 16465-9, (1989). Gerdes, S. Y., y col., J Bacteriol 185(19): 5673-84, (2003). Good, L., y col., Nat Biotechnol 19(4): 360-4, (2001). Good, L., y col., Microbiology 146 (Pt 10): 2665-70, (2000). Hale, C. A. y de Boer, P.A., J Bacteriol 181(1): 167-76, (1999). Jackowski, S. y Rock, C.O., J Biol Chem 258(24): 15186-91, (1983). Jackson, y col., Epidemiol. Infect 120(1): 17-20, (1998). Knudsen, H. y Nielsen, P.E., Nucleic Acids Res 24(3): 494-500, (1996). Lesnikowski, Z. J., y col., Nucleic Acids Res 18(8): 2109-15, (1990). Lutkenhaus, J. y Addinall, S.G., Annu Rev Biochem 66: 93-116, (1997). Mertes, M. P. y Coats, E.A., J Med Chem 12(1): 154-7, (1969). Miyada, C.G. y Wallace, R.B., Methods Enzymol. 154: 94-107, (1987). Nielsen, P. E., Pharmacol Toxicol 86(1): 3-7, (2000). Nikaido, H., J Bioenerg Biomembr 25(6):581-9, (1993). ES 2 367 289 T3 Partridge, M., y col., Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6(3): 169-75, (1996). Polacco, M. L. y Cronan, Jr., J.E., J Biol Chem 256(11): 5750-4, (1981). Rahman, M. A., y col., Antisense Res Dev 1(4): 319-27, (1991). Stein, D., y col., Antisense Nucleic Acid Drug Dev 7(3): 151-7, (1997). Summerton, J., Biochim Biophys Acta 1489(1): 141-58, (1999). 2 Summerton, J., y col., Antisense Nucleic Acid Drug Dev 7(2): 63-70, (1997). Summerton, J. y Weller, D., Antisense Nucleic Acid Drug Dev 7(3): 187-95, (1997). Zhang, Y. y Cronan, Jr., J.E., J Bacteriol 178(12): 3614-20, (1996). Zuker, M., Nucleic Acids Res 31(13): 3406-15, (2003). Antecedentes de la invención ES 2 367 289 T3 Actualmente existen varios tipos de compuestos antibióticos que se usan contra patógenos bacterianos, y estos compuestos actúan a través de una serie de mecanismos antibacterianos. Por ejemplo, los antibióticos de betalactama, tales como la penicilina y la cefalosporina, actúan para inhibir la etapa final de la síntesis de peptidoglicanos. Los antibióticos de glicopéptidos, que incluyen la vancomicina y la teicoplanina, inhiben tanto la transglicosilación como la transpeptidación de muramil-pentapéptido, interfiriendo de nuevo en la síntesis de peptidoglicanos. Otros antibióticos bien conocidos incluyen las quinolonas, que inhiben la replicación de ADN bacteriano, los inhibidores de ARN polimerasa bacteriana, tales como rifampina, y los inhibidores de enzimas del mecanismo de producción de tetrahidrofolato, que incluyen las sulfonamidas. Algunas clases de antibióticos actúan a nivel de síntesis de proteínas. Ejemplos destacables de los mismos son los aminoglicósidos, tales como la canamicina y la gentamicina. Esta clase de compuestos actúa sobre la subunidad de ribosoma 30S bacteriana, previniendo la asociación con la subunidad 50S para formar ribosomas funcionales. Las tetraciclinas, otra clase importante de antibióticos, también actúan sobre la subunidad de ribosoma 30S, previniendo el alineamiento de ARNts aminoacilados con el correspondiente codón de ARNm. Las macrolidas y las lincosamidas, otra clase de antibióticos, inhiben la síntesis bacteriana uniéndose a la subunidad de ribosoma 50S, e inhibiendo la elongación de péptidos o previniendo la traslocalización de ribosomas. A pesar de los logros impresionantes obtenidos en el control o en la eliminación de infecciones bacterianas mediante antibióticos, el uso extendido de antibióticos tanto en medicina humana como en suplemento de piensos para aves de corral y producción de animales vivos ha generado resistencia a fármaco en muchas bacterias patógenas. Los mecanismos de resistencia a antibióticos pueden adoptar diversas formas. Uno de los principales mecanismos de resistencia a beta lactamas, particularmente en bacterias Gram negativas, es la enzima beta-lactamasa, que hace que el antibiótico sea inactivo. Asimismo, la resistencia a aminoglicósidos a menudo implica una enzima capaz de desactivar el antibiótico, en este caso añadiendo un grupo fosforilo, adenilo o acetilo. El eflujo activo de antibióticos es otra forma en la que muchas bacterias desarrollan resistencia. Se han identificado los genes que codifican las proteínas de eflujo, tales como los genes tetA, tetG, tetL y tetK, para el eflujo de tetraciclina. Una diana bacteriana puede desarrollar resistencia alterando la diana del fármaco. Por ejemplo, las denominadas proteínas de unión a penicilina (PBPs, del inglés penicillin binding proteins) en muchas bacterias resistentes a beta-lactama son alteradas para inhibir la unión crítica del antibiótico a la proteína objetivo. La resistencia a tetraciclina puede implicar, además de un aumento del eflujo, la aparición de proteínas citoplásmicas capaces de competir con ribosomas por la unión al antibiótico. Para los antibióticos que actúan mediante la inhibición de una enzima bacteriana, tal como las sulfonamidas, mutaciones puntuales en la enzima diana pueden conferir resistencia. La aparición de resistencia a antibióticos en muchas bacterias patógenas (que en muchos casos implica resistencia multi-fármaco) ha extendido la sombra de una era pre-antibiótica en la que muchos patógenos bacterianos simplemente no pueden ser tratados mediante intervención médica. Existen dos factores principales que podrían contribuir a dicho escenario. El primero es la rápida extensión de la resistencia y de genes multi-resistencia a lo largo de cepas, especies y géneros bacterianos, mediante elementos conjugativos, siendo el más importante los plásmidos auto-transmisibles. El segundo factor es una falta de esfuerzos investigativos en la actualidad para descubrir nuevos tipos de antibióticos, debido en parte a la percepción de inversión en tiempo y dinero necesaria para descubrir nuevos agentes antibióticos y llevarlos a ensayos clínicos, un proceso que puede requerir un esfuerzo investigador de 20 años en algunos casos. Para afrontar el segundo de estos factores, se han propuesto algunas estrategias de descubrimiento de fármacos que pueden acelerar la investigación de nuevos antibióticos. Por ejemplo, se han presentado esfuerzos para escrutar e identificar nuevos compuestos antibióticos mediante escrutinio de alta capacidad, pero hasta la fecha no se han descubierto compuestos importantes mediante esta ruta. Se han propuesto varias estrategias que implican agentes antisentido diseñados para bloquear la expresión de genes de resistencia bacterianos o para actuar sobre dianas de ARN celular, tales como el ARNr en la subunidad de ribosoma 30S (Rahman, Summerton y col. 1991; Good y Nielsen, 1998). En general, estas estrategias solo han tenido éxito en un número limitado de casos, o han requerido concentraciones elevadas de antisentido (por ejemplo, Summerton, Stein y col., 1997), o el requisito de que las células tratadas muestren una alta permeabilidad para antibióticos (Good y Nielsen, 1998; Geller, Deere y col., 2003). 3 Por lo tanto, existe una creciente necesidad por obtener nuevos antibióticos que (i) no estén sujetos a los principales tipos de resistencia a antibióticos que dificultan hoy día el tratamiento con antibióticos de bacterias, (ii) puedan desarrollarse rápidamente y con un grado razonable de predictibilidad tal como especificidad de bacteria diana, (iii) también puedan ser diseñados para una actividad de amplio espectro, (iv) sean efectivos en dosis bajas, lo que significa, en parte, que sean captados eficientemente por bacterias naturales o incluso por bacterias que tengan una baja permeabilidad a antibióticos, y (v) muestren pocos efectos secundarios. Resumen de la invención La invención se define en las reivindicaciones. ES 2 367 289 T3 La invención incluye, en un aspecto general, un compuesto de oligonucleótido antisentido sustancialmente no cargado para inhibir el crecimiento de células bacterianas patógenas, y que tiene (i) no más de 12 bases de nucleótido, (ii) una secuencia de ácido nucleico de no menos de 10 bases de longitud dirigida contra un ARNm bacteriano que codifica una proteína de acpP, en la que... [Seguir leyendo]

1.- Un compuesto de oligonucleótido de morfolino antisentido sustancialmente no cargado para inhibir el crecimiento de células bacterianas patógenas, que consiste en subunidades de morfolino y enlaces intersubunidades que contienen fósforo y que unen un nitrógeno de morfolino de una subunidad con un carbono exocíclico 5 de otra subunidad adyacente, y que tiene: (i) no más de 12 bases de nucleótido, (ii) una secuencia de ácido nucleico de no menos de 10 bases de longitud dirigida contra un ARNm bacteriano que codifica la proteína acpP, en donde dicha secuencia de ácido nucleico dirigida es complementaria a una secuencia diana que contiene el codón de inicio de la traducción de dicho ARNm bacteriano o a una secuencia diana que contiene 20 bases por debajo (en dirección 3) del codón de inicio de la traducción de dicho ARNm bacteriano; y (iii) una Tm, cuando se encuentra hibridado a la secuencia diana, de entre 50ºC y 65ºC. 2.- El compuesto de la reivindicación 1, en el que las subunidades de morfolino del compuesto de oligonucleótido están unidas mediante enlaces de fosforodiamidato, según la estructura: en donde Y1=O, Z=O, Pj es un resto de emparejamiento de base de purina o pirimidina que es eficaz para unirse, mediante enlace de hidrógeno específico de base, a una base de un polinucleótido, y X es alquilo, alcoxi, tioalcoxi, amino o alquilamino, que incluye dialquilamino. 3.- El compuesto de la reivindicación 1 ó 2, en el que el compuesto de oligonucleótido tiene una secuencia dirigida que es complementaria a una secuencia diana que contiene el codón de inicio de la traducción del ARNm bacteriano. 4.- El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el compuesto de oligonucleótido tiene una secuencia dirigida que es complementaria a una secuencia diana de hasta 10 bases por debajo (en dirección 3) del codón de inicio de la traducción del ARNm bacteriano. 5.- El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el compuesto de oligonucleótido contiene sólo 11 bases, y su secuencia de ácido nucleico es completamente complementaria a la secuencia de ARNm diana. 6.- Una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de oligonucleótido antisentido como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para su uso en la inhibición de una infección bacteriana en un sujeto mamífero. 7.- El compuesto de oligonucleótido antisentido para el uso de la reivindicación 6, en el que el sujeto debe tratarse adicionalmente mediante la administración de un compuesto no antisentido que tenga actividad antibacteriana. 8.- Un compuesto para uso como medicamento, que comprende un compuesto de oligonucleótido de morfolino antisentido sustancialmente no cargado, que consiste en subunidades de morfolino y enlaces intersubunidades que contienen fósforo y que unen un nitrógeno de morfolino de una subunidad con un carbono exocíclico 5 de otra subunidad adyacente, y que tiene: (i) no más de 12 bases de nucleótido, ES 2 367 289 T3 (ii) una secuencia de ácido nucleico de no menos de 10 bases de longitud dirigida contra un ARNm bacteriano que codifica la proteína acpP, en donde dicha secuencia de ácido nucleico dirigida es complementaria a una secuencia diana que contiene el codón de inicio de la traducción de dicho ARNm bacteriano o a una secuencia diana que contiene 20 bases por debajo (en dirección 3) del codón de inicio de la traducción de dicho ARNm bacteriano; y 73 (iii) una Tm, cuando se encuentra hibridado a la secuencia diana, de entre 50ºC y 65ºC. 9.- El compuesto para el uso de la reivindicación 8, en el que las subunidades de morfolino del compuesto están unidas por enlaces de fosforodiamidato, según la estructura: 5 en donde Y1=O, Z=O, Pj es un resto de emparejamiento de base de purina o pirimidina que es eficaz para unirse, mediante enlace de hidrógeno específico de base, a una base de un polinucleótido, y X es alquilo, alcoxi, tioalcoxi, amino o alquilamino, que incluye dialquilamino. 10.-El compuesto para uso de la reivindicación 8 ó 9, en el que la secuencia dirigida del compuesto es complementaria a al menos diez bases contiguas en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEC 10 ID Nº: 2, 5, 8, 11 y 14. 11.-El compuesto para uso de la reivindicación 8 ó 9, que tiene una secuencia dirigida que es complementaria a una secuencia diana que contiene el codón de inicio de traducción del ARNm bacteriano. 12.-El compuesto para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 8, 9 u 11, que es complementario a una secuencia diana de hasta 10 bases por debajo (en la dirección 3) del codón de inicio de la traducción del ARNm 15 bacteriano. ES 2 367 289 T3 13.-El compuesto para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 8, 9, 11 ó 12, en el que el compuesto contiene solo 11 bases, y su secuencia de ácido nucleico es completamente complementaria a la secuencia diana de ARNm. 14.-El compuesto para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 8, 9, 11 ó 12, en el que el compuesto contiene solo 10 bases, y su secuencia de ácido nucleico es completamente complementaria a la secuencia diana de ARNm. 74 FIGURAS ES 2 367 289 T3 ES 2 367 289 T3 76 ES 2 367 289 T3 77 ES 2 367 289 T3 78 ES 2 367 289 T3 79 ES 2 367 289 T3 ES 2 367 289 T3 81 ES 2 367 289 T3 82 ES 2 367 289 T3 83 ES 2 367 289 T3 84 ES 2 367 289 T3 ES 2 367 289 T3 86 ES 2 367 289 T3 87 ES 2 367 289 T3 88