COMPUESTO OLIGÓMERO ANTISENTIDO SUSTITUIDO CON INOSINA, CONJUGADO CON UN PÉPTIDO, Y MÉTODO DE PREPARACIÓN.

Un método para la preparación de un compuesto análogo oligonucleotídico sustancialmente no cargado,

método que comprende formar un producto de conjugación del compuesto con un péptido rico en arginina eficaz para potenciar la incorporación del compuesto a células diana, en que el compuesto incluye una cadena de bases que son complementarias de cuatro o más bases de citosina contiguas de una región de ácido nucleico diana, y en que al menos una base de guanina está sustituida por una base de inosina en dicha cadena de bases con objeto de limitar a tres o menos el número de bases de guanina contiguas en dicha cadena.

Compuesto oligómero antisentido sustituido con inosina, conjugado con un péptido, y método de preparación.

Este invento se refiere a un compuesto oligómero antisentido (i) conjugado con un péptido rico en arginina y eficaz para potenciar la incorporación del oligómero a células, y (ii) en el que cadenas de bases de G están interrumpidas por una o más bases de inosina, y a métodos para usar dicho compuesto. Los oligómeros antisentido ofrecen un gran potencial como compuestos farmacéuticos, como viene evidenciado por el número de fármacos antisentido actualmente en desarrollo clínico y facilitado por el hecho de que a lo largo de los últimos años se han abordado exitosamente diversas limitaciones potenciales de los oligómeros antisentido (Devi, Stein) . Se han desarrollado nuevas cadenas principales no cargadas de oligómeros para mejorar la incorporación a células y para aumentar la resistencia a la degradación por nucleasas (Hudziak, Iversen, Summerton) . Se ha hallado que para ciertas estructuras de oligómeros, por ejemplo, las estructuras basadas en morfolino, la cadena principal modificada proporciona una afinidad de unión potenciada a su ácido nucleico diana (Iversen, Summerton) . Más recientemente, se ha descubierto que una diversidad de péptidos ricos en arginina pueden aumentar drásticamente el nivel de incorporación de oligonucleótidos no cargados a células, incluyendo células de mamífero (véanse, por ejemplo, la solicitud de patente de EE.UU SN 60/466.703 de propiedad conjunta, presentada el 29 de abril de 2003, y la correspondiente solicitud de patente de EE.UU. para "Compositions for Enhancing Transport of Molecules into Cells", presentada el 29 de abril de 2004) . Este descubrimiento tiene el potencial para aumentar significativamente el potencial terapéutico de una diversidad de oligómeros antisentido, incluyendo los destinados a bloquear la expresión de proteínas seleccionadas, los centrados en bloquear ciertos sitios de corte y empalme dadores o aceptores en mRNA preprocesado, y los diseñados para tratar una infección vírica al bloquear la expresión de genes víricos o la replicación de genomas víricos de cadena sencilla. En ciertas aplicaciones antisentido, la secuencia diana óptima contra la cual se dirige el oligómero antisentido puede incluir una serie de cuatro o más bases de citosina, en cuyo caso el oligómero contendrá la correspondiente cadena de cuatro o más bases de guanina complementarias. Como un ejemplo importante, una secuencia diana óptima para la proteína c-myc es una región que contiene el sitio de inicio AUG del RNA de c-myc que incluye una serie de cuatro bases de citosina. Los oligómeros antisentido dirigidos contra la región codónica de inicio de c-myc tienen diversas aplicaciones terapéuticas importantes, incluyendo el tratamiento del cáncer, la enfermedad del riñón poliquístico (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. nO 6.875.747 de propiedad conjunta) y la reestenosis de vasos coronarios (véase, por ejemplo, la solicitud de patente PCT WO 00/44897 de propiedad conjunta, publicada el 08/03/2000) , y la terapia del cáncer (véase, por ejemplo, la solicitud de patente de EE.UU. US-2003-0087861-A1 de propiedad conjunta, publicada el 05/08/2003) .

H. M. Moulton et al., Bioconjugate Chemistr y , ACS, Washington, DC, EE.UU., volumen 15, nO 2 (2004) , páginas 290299, describen un método de distribución celular para oligonucleótidos antisentido al conjugar péptidos ricos en arginina con oligómeros de morfolino. Sorprendentemente, se ha hallado ahora que la conjugación de un péptido rico en arginina con compuestos antisentido que tienen series de cuatro o más bases de citosina, en un esfuerzo para potenciar la incorporación celular del oligómero, compromete gravemente la actividad antisentido del compuesto así como la capacidad para purificar el compuesto. Aunque no se entiende la base de este problema, parece que está implicada una interacción entre el péptido positivamente cargado y el compuesto oligómero de un modo que 45 activa la formación de cuádruplos de G en el oligómero, reduciéndose de este modo la solubilidad y/o la capacidad del compuesto para unirse a su ácido nucleico diana. Por lo tanto, sería útil potenciar la incorporación celular de dichos compuestos oligómeros antisentido, al conjugar el compuesto con un péptido rico en arginina, sin degradar la actividad antisentido del compuesto con respecto a su diana intracelular. En particular, sería útil potenciar la incorporación celular del anterior compuesto antisentido de c-myc sin pérdida de actividad antisentido, con el fin de potenciar la actividad terapéutica del compuesto en el tratamiento del cáncer, la enfermedad del riñón poliquístico o la reestenosis de vasos coronarios. El presente invento proporciona un método para la preparación de un compuesto análogo oligonucleotídico sustan

55 cialmente no cargado, método que comprende formar un producto de conjugación del compuesto con un péptido rico en arginina y eficaz para potenciar la incorporación del compuesto a células diana, en que el compuesto incluye una cadena de bases que son complementarias de cuatro o más bases de citosina contiguas de una región de ácido nucleico diana, y en que al menos una base de guanina está sustituida por una base de inosina en dicha cadena de bases con objeto de limitar a tres o menos el número de bases de guanina contiguas en dicha cadena. La sustitución da lugar a una mejora que puede ser eficaz para potenciar la solubilidad del producto de conjugación en agua durante una operación de purificación que implica que el producto de conjugación se una a, y se libere de, una resina de intercambio catiónico, con respecto al mismo producto de conjugación en ausencia de la sustitución por inosina. Cuando la región de ácido nucleico diana incluye el codón de inicio en un mRNA, la mejora puede ser 65 eficaz para potenciar la capacidad del producto de conjugación para bloquear la traducción de la proteína codificada

por el mRNA, con respecto al mismo producto de conjugación en ausencia de la sustitución por inosina. Cuando la región de ácido nucleico diana incluye un sitio de corte y empalme dador o aceptor en un mRNA preprocesado, la mejora puede ser eficaz para potenciar la capacidad del producto de conjugación para enmascarar el corte y empalme de mRNA en la región diana, con respecto al mismo producto de conjugación en ausencia de la sustitución por inosina.

Cuando la región de ácido nucleico diana incluye un elemento víricamente codificado de acción en cis implicado en la replicación vírica, la mejora puede ser eficaz para potenciar la capacidad del producto de conjugación para bloquear la replicación vírica, con respecto al mismo producto de conjugación en ausencia de la sustitución por inosina.

En una realización ejemplar, el péptido rico en arginina comprende de 8 a 16 subunidades seleccionadas entresubunidades X, subunidades Y, y subunidades Z opcionales, incluyendo al menos seis subunidades X, al menos dos subunidades Y y a lo sumo tres subunidades Z, en que > 50% de dichas subunidades son subunidades X, y en que

(a) cada subunidad X representa independientemente arginina o un compuesto análogo a arginina, siendo dicho compuesto análogo un ∀-aminoácido catiónico que comprende una cadena lateral de estructura R1N=C (NH2) R2 en que R1 es H o R, y R2 es R, NH2, NHR o NR2, en que R es alquilo inferior o alquenilo inferior y puede incluir además oxígeno o nitrógeno; R1 y R2 pueden formar conjuntamente un anillo; y la cadena lateral está unida a dicho aminoácido a través de R1 o R2;

(b) cada subunidad Y representa independientemente un aminoácido neutro -C (O) - (CHR) n-NH-, en que (i) n es de 2 a 7 y cada R es independientemente H o metilo, o (ii) n es 1 y R es una cadena lateral neutra seleccionada entre alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo y aralquilo sustituidos o no sustituidos, en que dicha cadena lateral neutra, cuando es seleccionada entre alquilo, alquenilo y alquinilo sustituidos, incluye a lo sumo un heteroátomo por cada cuatro átomos de carbono; y

(c) cada subunidad Z representa independientemente un aminoácido seleccionado entre alanina, asparagina, cisteína, glutamina, glicocola, histidina, lisina, metionina, serina y treonina.

También en una realización ejemplar, el compuesto oligonucleotídico es un oligómero de morfolino compuesto de subunidades de morfolino unidas por enlaces que contienen fósforo entre el nitrógeno del morfolino de una subunidad y un carbono exocíclico en la posición 3 del morfolino de una subunidad adyacente. Las subunidades de morfo-

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1. Un método para la preparación de un compuesto análogo oligonucleotídico sustancialmente no cargado, método que comprende formar un producto de conjugación del compuesto con un péptido rico en arginina eficaz pa

ra potenciar la incorporación del compuesto a células diana, en que el compuesto incluye una cadena de bases que son complementarias de cuatro o más bases de citosina contiguas de una región de ácido nucleico diana, y en que al menos una base de guanina está sustituida por una base de inosina en dicha cadena de bases con objeto de limitar a tres o menos el número de bases de guanina contiguas en dicha cadena.

2. El método de la Reivindicación 1, en que al menos una base de guanina está sustituida por una base de inosina en dicha cadena de bases con objeto de limitar a dos o menos el número de bases de guanina contiguas en dicha cadena.

3. El método de la Reivindicación 1 ó 2, en que al menos dos bases de guanina están sustituidas por bases de 15 inosina en dicha cadena de bases.

4. El método de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3, en que dicha sustitución es eficaz para potenciar la solubilidad del producto de conjugación en agua durante una operación de purificación que implica que el producto de conjugación se una a, y se libere de, una resina de intercambio catiónico, con respecto al mismopro

ducto de conjugación en ausencia de la sustitución por inosina.

5. El método de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, en que dicha región de ácido nucleico diana incluye el codón de inicio en un mRNA, y dicha sustitución es eficaz para potenciar la capacidad del producto de conjugación para bloquear la traducción de la proteína codificada por el mRNA, con respecto al mismo producto de con

jugación en ausencia de la sustitución por inosina.

6. El método de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5, en que dicha región de ácido nucleico diana incluye un sitio de corte y empalme dador o aceptor en un mRNA preprocesado, y dicha sustitución es eficaz para potenciar la capacidad del producto de conjugación para enmascarar el corte y empalme de mRNA en dicha región diana, con respecto al mismo producto de conjugación en ausencia de la sustitución por inosina.

7. El método de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 6, en que dicha región de ácido nucleico diana incluye un elemento víricamente codificado de acción en cis implicado en la replicación vírica, y dicha sustitución es eficaz para potenciar la capacidad del producto de conjugación para bloquear la replicación vírica, con respecto al mismo producto de conjugación en ausencia de la sustitución por inosina.

8. El método de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 7, en que dicho péptido rico en arginina comprende de 8 a 16 subunidades seleccionadas entre subunidades X, subunidades Y, y subunidades Z opcionales, incluyendo al menos seis subunidades X, al menos dos subunidades Y y a lo sumo tres subunidades Z, en que > 50% de di

chas subunidades son subunidades X, y en que (a) cada subunidad X representa independientemente arginina o un compuesto análogo a arginina, siendo dicho compuesto análogo un ∀-aminoácido catiónico que comprende una cadena lateral de estructura R1N=C (NH2) R2 en que R1 es H o R, y R2 es R, NH2, NHR o NR2, en que R es alquilo inferior o alquenilo infe

45 rior y puede incluir además oxígeno o nitrógeno; R1 y R2 pueden formar conjuntamente un anillo; y la cadena lateral está unida a dicho aminoácido a través de R1 o R2;

(b) cada subunidad Y representa independientemente un aminoácido neutro -C (O) - (CHR) n-NH-, en que (i) n es de 2 a 7 y cada R es independientemente H o metilo, o (ii) n es 1 y R es una cadena lateral neutra selec

50 cionada entre alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo y aralquilo sustituidos o no sustituidos, en que dicha cadena lateral neutra, cuando es seleccionada entre alquilo, alquenilo y alquinilo sustituidos, incluye a lo sumo un heteroátomo por cada cuatro átomos de carbono; y (c) cada subunidad Z representa independientemente un aminoácido seleccionado entre alanina, asparagi55 na, cisteína, glutamina, glicocola, histidina, lisina, metionina, serina y treonina.

9. El método de la Reivindicación 8, en que dicho compuesto análogo oligonucleotídico es un oligómero de morfo-lino compuesto de subunidades de morfolino unidas por enlaces que contienen fósforo entre el nitrógeno del morfolino de una subunidad y un carbono exocíclico en la posición 3 del morfolino de una subunidad adyacente.

10. El método de la Reivindicación 9, en que dichas subunidades de morfolino están unidas por enlaces fosforodiamidato no cargados, de acuerdo con la estructura:

en que Y1 = O, Z = O, Pj es un componente para apareamiento de bases de purina o pirimidina eficaz para unirse, mediante un enlace de hidrógeno específico de bases, con una base de un polinucleótido, y X es alquilo, alcoxilo, tioalcoxilo o alquilamino.

11. Un producto de conjugación de oligómero-péptido, que comprende (a) un compuesto análogo oligonucleotídico sustancialmente no cargado que tiene una secuencia de bases que incluye una cadena de bases que son complementarias de cuatro o más bases de citosina contiguas de una re10 gión de ácido nucleico diana, y (b) conjugado con dicho compuesto, un péptido rico en arginina eficaz para potenciar la incorporación del compuesto a células diana, en que dicha cadena de bases del compuesto incluye al menos una base de inosina, dispuesta en dicha cadena con objeto de limitar a tres o menos el número de bases de guanina contiguas en dicha cadena.

12. El producto de conjugación de la Reivindicación 11, en que el producto de conjugación es como se define en la Reivindicación 2, 3, 4, 8, 9, 10 ó 14.

13. El producto de conjugación de la Reivindicación 11 ó 12, en que dicho compuesto incluye una secuencia para transporte dirigido seleccionada del grupo que consiste en las ID. SEC. números 2-10.

1º. El método de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8, en que el compuesto análogo oligonucleotídico sustancialmente no cargado comprende una cadena principal que comprende componentes de morfolino, metilfosfo25 nato, fosforotioato, fosfodiéster o ácido nucleico peptídico.

15. El producto de conjugación de cualquiera de las Reivindicaciones 11, 12 y 13, en que dicho péptido rico en arginina comprende de 8 a 16 subunidades seleccionadas entre subunidades X, subunidades Y, y subunidades Z opcionales, incluyendo al menos seis subunidades X, al menos dos subunidades Y y a lo sumo tres subuni

dades Z, en que > 50% de dichas subunidades son subunidades X, y en que (a) cada subunidad X representa independientemente arginina o un compuesto análogo a arginina, siendo dicho compuesto análogo un ∀-aminoácido catiónico que comprende una cadena lateral de estructura R1N=C (NH2) R2 en que R1 es H o R, y R2 es R, NH2, NHR o NR2, en que R es alquilo inferior o alquenilo infe

rior y puede incluir además oxígeno o nitrógeno; R1 y R2 pueden formar conjuntamente un anillo; y la cadena lateral está unida a dicho aminoácido a través de R1 o R2;

(b) cada subunidad Y representa independientemente un aminoácido neutro -C (O) - (CHR) n-NH-, en que (i) n es de 2 a 7 y cada R es independientemente H o metilo, o (ii) n es 1 y R es una cadena lateral neutra selec

cionada entre alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo y aralquilo sustituidos o no sustituidos, en que dicha cadena lateral neutra, cuando es seleccionada entre alquilo, alquenilo y alquinilo sustituidos, incluye a lo sumo un heteroátomo por cada cuatro átomos de carbono; y (c) cada subunidad Z representa independientemente un aminoácido seleccionado entre alanina, asparagi45 na, cisteína, glutamina, glicocola, histidina, lisina, metionina, serina y treonina.

16. El producto de conjugación de la Reivindicación 15, en que dicho péptido rico en arginina incluye una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las ID. SEC. números 16, 17 y 18.

50 17. El producto de conjugación de cualquiera de las Reivindicaciones 11, 12, 13, 15 y 16, en que dicho compuesto análogo oligonucleotídico es un oligómero de morfolino compuesto de subunidades de morfolino unidas por enlaces que contienen fósforo entre el nitrógeno del morfolino de una subunidad y un carbono exocíclico en la posición 3 del morfolino de una subunidad adyacente.

18. El producto de conjugación de la Reivindicación 17, en que dichas subunidades de morfolino están unidas por enlaces fosforodiamidato no cargados, de acuerdo con la estructura:

en que Y1 = O, Z = O, Pj es un componente para apareamiento de bases de purina o pirimidina eficaz para unirse, mediante un enlace de hidrógeno específico de bases, con una base de un polinucleótido, y X es alquilo, alcoxilo, tioalcoxilo o alquilamino.

19. El producto de conjugación de cualquiera de las Reivindicaciones 11, 12, 13, 15, 16 y 17, en que el compuesto análogo oligonucleotídico sustancialmente no cargado comprende una cadena principal que comprende componentes de morfolino, metilfosfonato, fosforotioato, fosfodiéster o ácido nucleico peptídico.