MÉTODO PARA LA EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE TACROLIMUS USANDO DETERGENTES ACUOSOS.

Método para la extracción y cuantificación de tacrolimus usando detergentes acuosos. Campo técnico La presente invención se refiere a un método de extracción de tacrolimus simple a partir de una muestra para ensayo para su uso en un ensayo de cuantificación de tacrolimus completamente automatizado. Antecedentes Tracolimus (también conocido como ProGraf ® y FK506) es un antibiótico de macrólido de lactona con potentes propiedades inmunosupresoras, aislado a partir de los hongos terrestres Streptomyces tsukubaensis. Tracolimus exhibe sus efectos inmunosupresores inhibiendo la ruta de la calcineurina (que finalmente inhibe la proliferación de linfocitos T) a través de la formación de un complejo pentamérico entre tracolimus, proteínas de unión FK (FKBP), calmodulina y calcineurinas A y B (McKeon et al., Cell Vol.66, páginas 823-6 (1991)). Tracolimus se une fuertemente a FKBP (Kd-0,4 nM), y también se sabe que se une a la ciclofilina (Handshumacher et al, Science Vol. 226, páginas 544-547 (1984)), albúminas, y alfa-1 glucoproteína ácida (Wong, Clinica Chimica' Acta Vol. 323, páginas 241-253 (2001)). Tracolimus, usado en combinación con otros inmunosupresores, ha conseguido una amplia aceptación para el tratamiento del rechazo de los tejidos tras un trasplante de órganos. La variabilidad extrema de un paciente a otro entre la dosis del fármaco y los niveles de fármaco en sangre conduce a su potencial de toxicidad, por lo que el control terapéutico de los niveles de tracolimus en pacientes sometidos a terapia inmunosupresora con tracolimus es una práctica convencional. Tracolimus es captado en gran medida en los eritrocitos (glóbulos rojos o RBC), unidos a la proteína de unión FK (FKBP, por lo tanto, las muestras de sangre completa son una matriz preferida para el control terapéutico de tracolimus en sangre, aunque puede extraerse de muestras de las biopsias, médula ósea y otros fluidos corporales. Tracolimus también forma complejos con otros constituyentes del plasma sanguíneo, tales como inmunofilinas, albúmina y lipoproteínas. Para determinar la presencia de tracolimus y su concentración en una muestra de sangre humana, los RBC presentes en la muestra deben lisarse para liberar los complejos tracolimus/proteína. Después, los complejos tracolimus/proteína deben disociarse para liberar tracolimus. Tracolimus tiene una solubilidad limitada en soluciones acuosas. Consecuentemente, todos los ensayos de tracolimus disponibles usan disolventes orgánicos para extraer el fármaco para su ensayo. Se han usado rutinariamente disolventes orgánicos (por ejemplo, acetato de etilo, metanol, cloruro de metileno) para lisar los glóbulos rojos, para desnaturalizar las proteínas y para extraer tracolimus en preparación para su cuantificación, Alak A. M., "Measurements of tracolimus (FK506) and its metabolites: A review of assay development and application in therapeutic drug monitoring and pharmacokinetic studies", Therapeutic drug monitoring, New York, NY, US, vol. 19, Junio 1997 (06-1997)), páginas 338-351, que es una revisión de los protocolos para las mediciones de tracolimus en el control terapéutico del fármaco y estudios farmacocinéticos, se discuten protocolos para la extracción de tracolimus de muestras de sangre usando disolventes orgánicos como cloruro de metileno, acetato de etilo o metanol El uso de procedimientos basados en disolventes orgánicos sufre de varias desventajas significativas. Por ejemplo, los disolventes orgánicos son muy volátiles, altamente inflamables e implican materiales peligrosos que deben eliminarse adecuadamente de acuerdo con las directrices medioambientales La volatilidad de los disolventes orgánicos puede interferir también con la cuantificación precisa de tracolimus en relación con la evaporación acumulada de los disolventes orgánicos. La evaporación excesiva en cada etapa de la extracción y durante las incubaciones de la muestra del ensayo, pueden dar como resultado niveles artificialmente elevados de tracolimus en la detección. Todos los procedimientos actuales para la extracción de tracolimus requieren una preparación manual compleja de la muestra. Los procedimientos actuales requieren una etapa de desnaturalización/extracción de una muestra, una etapa de centrifugación y una etapa de decantación del sobrenadante. Los métodos de extracción manual de tracolimus actuales son procesos lentos, que suponen un trabajo intensivo. Normalmente implican el pipeteo preciso de cuatro componentes: la muestra, el agente desnaturalizante, el agente de extracción y la muestra extraída. La precisión del pipeteo manual consume mucho tiempo y es poco fiable. Consecuentemente, estos procedimientos son caros en términos de costes asociados con la dotación de personal. También son técnicamente limitados en términos de rendimiento analítico y en la cuantificación precisa del tracolimus. El uso de disolventes orgánicos junto con etapas de desnaturalización, centrifugación y decantación, requeridos por los procedimientos de pretratamiento de muestra actuales, imposibilitan el ensayo de cuantificación de tracolimus completamente automatizado , Para que sea posible la cuantificación automatizada completa, todos los reactivos y 2   las muestras deben permanecer en una forma acuosa. Ya no sería necesario la desnaturalización (lisis) y la centrifugación de las muestras de sangre. El uso de soluciones acuosas también eliminaría los efectos de la evaporación excesiva, y los riesgos asociados con el uso de condiciones volátiles, inflamables y potencialmente explosivas en un dispositivo eléctrico. Consecuentemente, hay una necesidad e interés en la técnica de elaborar un método de cuantificación de tracolimus completamente automatizado, que elimine la necesidad del pretratamiento de la muestra, elaborado y laborioso Tal método representaría una mejoría considerable respecto a los métodos actuales conocidos en la técnica, en términos de costes por ensayo. La eliminación de la interacción manual del usuario con las muestras también mejoraría la reproducibilidad del método, mediante la eliminación de errores humanos, que pueden afectar a la extracción del fármaco (y por lo tanto, al resultado posterior). La presente invención proporciona un método para la extracción de tracolimus en un medio acuoso sin precipitación, sin desnaturalización, que no sólo elimina el uso de disolventes orgánicos y centrifugación, sino que también cumple los requisitos para un ensayo de cuantificación automatizada de tracolimus. Breve descripción de las figuras La Figura 1 presenta gráficamente una curva dosis-respuesta de un ensayo semi-automatizado de tracolimus realizado en el analizador ARCHITECT TM (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) usando una sal biliar como agente de extracción de tracolimus. La Figura 2 es una curva dosis-respuesta de un ensayo completamente automatizado realizado en el analizador IMx TM (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) usando una sal biliar como agente de extracción de tracolimus. La Figura 3 compara gráficamente los resultados de las muestra de los pacientes a los que se les ha administrado tracolimus de un ensayo completamente automatizado usando extracción con sal biliar frente a los resultados de un ensayo disponible en el mercado usando extracción con disolvente orgánico manual. La Figura 4 es una curva dosis-respuesta de un ensayo de tracolimus completamente automatizado realizado en el analizador IMx TM usando cinco sales biliares diferentes para la extracción. La Figura 5 compara gráficamente dos curvas dosis-respuesta de una extracción de tracolimus completamente automatizada usando desoxicolato y CHAPS en el analizador IMx TM . Descripción detallada de la invención La presente invención proporciona un método acuoso para la extracción de tracolimus sin precipitación, sin desnaturalización, que permite un método de cuantificación de tracolimus completamente automatizado en una muestra de sangre para ensayo, sin la necesidad de pretratamiento manual. Puesto que tracolimus está unido en gran medida a los RBC, la muestra de sangre para ensayo preferida es sangre completa, aunque puede ser una muestra que contenga los RBC lavados previamente. El método de la presente invención comprende mezclar la muestra de sangre para ensayo con al menos un agente hemolítico y al menos un agente de extracción de tracolimus. Los dos agentes pueden añadirse en una etapa o en etapas separadas. El agente hemolítico lisa los glóbulos rojos resultantes en la liberación del complejo tracolimus/proteína. Para el fin de la presente invención, los términos "hemolítico", "eritrocítico" o "eritrolítico" tienen el mismo significado, es decir, la ruptura de los glóbulos rojos, dando como resultado la liberación de los contenidos intracelulares. El agente de extracción disocia o libera... [Seguir leyendo]

1. Un método de extracción de tracolimus de una muestra de sangre, que comprende poner el contacto de una muestra de sangre con un agente hemolítico detergente no-iónico y un agente de extracción soluble en agua. 2. El método de la reivindicación 1, en el que la muestra de sangre se proporciona en un medio acuoso no desnaturalizante. 3. El método de la reivindicación 1, en el que el agente hemolítico detergente no-iónico se selecciona entre el grupo que consiste en saponina y octilfenoxi polietoxietanol. 4. El método de la reivindicación 1, en el que el agente de extracción comprende un resto ciclopentanoperhidrofenantreno (colesterol). 5. El método de la reivindicación 4, en el que el agente de extracción se selecciona entre el grupo que consiste en detergentes de sal biliar aniónica y detergentes de sal biliar zwitteriónica. 6. El método de la reivindicación 5, en el que el agente de extracción es un detergente de sales biliares aniónicas seleccionado entre el grupo que consiste en sales biliares conjugadas y no conjugadas. 7. El método de la reivindicación 6, en el que dicho detergente de sal biliar es una sal biliar conjugada. 8. El método de la reivindicación 7, en el que dicha sal biliar conjugada se selecciona entre el grupo que comprende glicocolato y taurodesoxicolato. 9. El método de la reivindicación 8, en el que dicha sal biliar es una sal biliar no conjugada. 10. El método de la reivindicación 9, en el que dicha sal biliar no conjugada se selecciona entre el grupo que comprende colato, desoxicolato y quenodesoxicolato. 11. El método de la reivindicación 10, en el que dicha sal biliar es desoxicolato. 12. El método de la reivindicación 5, en el que el agente de extracción es un detergente de sal biliar zwitteriónica. 13. El método de la reivindicación 12, en el que el detergente de sal biliar zwitteriónica es 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-propano-sulfonato hidrato. 14. Un método de determinación de la concentración de tracolimus en una muestra de sangre para ensayo, en un medio acuoso no desnaturalizante, que comprende el proceso de: (a) mezclar una muestra de sangre para ensayo con un agente hemolítico detergente no-iónico y un agente de extracción soluble en agua, (b) lisar dicha muestra de sangre mediante dicho agente hemolítico, (c) extraer tracolimus mediante dicho agente de extracción soluble en agua, y (d) determinar la concentración de tracolimus en dicha muestra de sangre en un sistema automatizado, en el que la concentración determinada de tracolimus extraído corresponde a la concentración de tracolimus presente en dicha muestra de sangre. 15. El método de la reivindicación 14, en el que el agente hemolítico es octilfenoxi polietoxietanol, y el agente de extracción soluble en agua es desoxicolato. 16. El método de la reivindicación 14, en el que el método de determinación de la concentración de tracolimus en la muestra es mediante un inmunoensayo. 17. El método de la reivindicación 14, en el que el método de determinación de la concentración de tracolimus en la muestra es mediante un ensayo de unión al receptor de inmunofilina. 18. El método de la reivindicación 16, en el que el método de inmunoensayo se selecciona entre el grupo que comprende radioinmunoensayo (RIA), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), ensayo inmunoabsorbente enzimático de micropartículas (MEIA), ensayo de captura de iones, y ensayo basado en quimioluminiscencia. 19. Un kit de ensayo adecuado para la detección del nivel de tracolimus en una muestra de sangre humana completa usando un sistema automático, comprendiendo dicho kit un agente hemolítico detergente no-iónico y un agente de extracción soluble en agua. 8   20. El kit de ensayo de la reivindicación 19, en el que el agente hemolítico se selecciona entre el grupo que consiste en octilfenoxi polietoxietanol y saponina. 21. El kit de ensayo de la reivindicación 20, en el que dicho agente hemolítico es octilfenoxi polietoxietanol. 22. El kit de ensayo de la reivindicación 19, en el que el agente de extracción soluble en agua es un resto ciclopentanoperhidrofenantreno (colesterol). 23. El kit de ensayo de la reivindicación 22, en el que el agente de extracción se selecciona entre el grupo que consiste en detergentes de sal biliar aniónica, y detergentes de sal biliar zwitteriónica. 24. El kit de ensayo de la reivindicación 23, en el que el detergente de sal biliar aniónica se selecciona entre sales biliares conjugadas y no conjugadas. 25. El kit de ensayo de la reivindicación 24, en el que el detergente de sal biliar es una sal biliar conjugada. 26. El kit de ensayo de la reivindicación 25, en el que la sal biliar conjugada se selecciona entre el grupo que comprende glicocolato y taurodesoxicolato. 27. El kit de ensayo de la reivindicación 24, en el que la sal biliar es una sal biliar no conjugada. 28. El kit de ensayo de la reivindicación 27, en el que la sal biliar no conjugada se selecciona entre el grupo que comprende colato, desoxicolato y quenodesoxicolato. 29. El kit de ensayo de la reivindicación 28, en el que dicha sal biliar es desoxicolato. 30. El kit de ensayo de la reivindicación 23, en el que el agente de extracción es un detergente de sales biliares zwitteriónicas. 31. El kit de ensayo de la reivindicación 30, en el que el detergente de sal biliar zwitteriónica es 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-propanosulfonato hidrato. 32. El kit de ensayo de la reivindicación 19, en el que dicho kit de ensayo puede usarse en una plataforma de ensayo semi-automatizada. 33. El kit de ensayo de la reivindicación 19, en el que dicho kit de ensayo puede usarse en una plataforma de ensayo automatizada. 9     11   12   13   14