Un inmunoensayo para detectar doxorrubicina en una muestra que comprende proporcionar una mezcla de a) dicha muestra,

b) un anticuerpo que es reactivo selectivamente con doxorrubicina y tiene una reactividad cruzada con respecto a doxorrubicina con doxorrubicina aglicona de menos del 20 % y c) un conjugado de un vehículo que tiene un **(Ver fórmula)**en la que Aes =N-O-, o Y es un grupo espaciador orgánico; X es un grupo funcional capaz de unirse a dicho vehículo a través de dicho grupo amino o tiol; y p es un número entero de 0 a 1; o un compuesto de fórmula: en la que X, Y y p son como se han definido anteriormente y B es -CH2-o o una mezcla de los mismos; **(Ver fórmula)****(Ver fórmula)**provocando que la doxorrubicina en la muestra y dicho conjugado en dicha mezcla se unan en dicha mezcla con dicho anticuerpo y, después de ello, midiendo la cantidad de dicho conjugado en dicha mezcla que se une o separa de dicho anticuerpo, de manera que puede determinarse la presencia de doxorrubicina en la muestra

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al campo de los ensayos inmunológicos para determinar la presencia y/o cuantificar la cantidad de doxorrubicina y metabolitos 5 farmacéuticamente activos en fluidos biológicos humanos con el fin de determinar rápidamente

las concentraciones óptimas del fármaco durante la quimioterapia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

“Cáncer” es un término usado para describir un grupo de malignidades que comparten el rasgo común de desarrollarse cuando empiezan a crecer sin control células en una parte del cuerpo. La mayoría de los cánceres forman tumores, pero también pueden manifestarse en la sangre y circular por otros tejidos en los que crecen. Las malignidades cancerosas se tratan la mayoría de las veces con una combinación de cirugía, quimioterapia y/o radioterapia. El tipo de tratamiento usado para tratar un cáncer específico depende de varios factores que incluyen el tipo de malignidad cancerosa y el estadio durante el que se diagnosticó.

15 La doxorrubicina, también conocida como adriamicina, es uno de los agentes citotóxicos más comunes usados para el tratamiento del cáncer de mama. La adriamicina, que es la sal clorhidrato comercial de doxorrubicina, tiene la fórmula:

**(Ver fórmula)**

Este compuesto se ha asociado con efectos secundarios debilitantes tales como cardiotoxicidad, mielosupresión, hipersensibilidad, náuseas y vómitos. Mediante el control de los niveles de doxorrubicina en el cuerpo y el ajuste de la dosis, estos efectos secundarios pueden controlarse mejor y limitarse en los pacientes.

Al mismo tiempo, con frecuencia existe una relación muy variable entre la dosis de doxorrubicina y la concentración del fármaco en suero resultante que afecta al efecto 25 terapéutico. El grado de variabilidad farmacocinética intra-e interindividual de la doxorrubicina

puede ser de hasta 5 veces y se ve afectado por muchos factores, que incluyen: ο Función de los órganos ο Regulación genética ο Estado de la enfermedad

ο Edad

ο Interacción fármaco-fármaco

ο Momento de ingestión del fármaco

ο Modo de administración del fármaco, y

ο Administración relacionada con la técnica.

Como resultado de esta variabilidad, dosis iguales del mismo fármaco en diferentes individuos pueden producir resultados clínicos radicalmente diferentes (Hon y col. Clinical Chemistry 44, págs. 388-400, 1998). La eficacia de la misma dosificación de doxorrubicina varía de forma significativa basándose en la eliminación individual del fármaco y la concentración final de fármaco en suero en el paciente. La monitorización de fármacos terapéuticos proporcionaría al médico una perspectiva sobre la variación entre los pacientes de la administración intravenosa de fármacos. Con la monitorización de fármacos terapéuticos podrían individualizarse dosificaciones de fármacos para el paciente, y las probabilidades de tratar eficazmente el cáncer, sin los efectos secundarios indeseados, serían mucho mayores.

Además, la monitorización de fármacos terapéuticos de doxorrubicina serviría como una herramienta excelente para asegurar el cumplimiento de la administración de la quimioterapia con la dosis prescrita real y la obtención de los niveles de concentración en suero eficaces. Se ha descubierto que la variabilidad en la concentración en suero no sólo se debe a factores fisiológicos, sino que también puede deberse a una variación en la técnica de administración.

La monitorización de fármacos terapéuticos rutinaria de la doxorrubicina requeriría la disponibilidad de ensayos automáticos sencillos adaptables a equipos de laboratorio generales. Los ensayos que cumplen mejor estos criterios son inmunoensayos tales como un radioinmunoensayo y un ensayo de inmunoabsorbente ligado a enzima. Watanabe T. y col., Tokai J. Exp Clin Med, 1990, Vol. 15, Nº. 4, págs. 327-334. Sin embargo, los anticuerpos correspondientes usados en estos inmunoensayos tienen que demostrar una amplia reactividad cruzada con doxorrubicina, sin ninguna actividad sustancial con metabolitos de doxorrubicina que no son farmacéuticamente activos. Para ser eficaces en el control de los niveles de fármaco de doxorrubicina, el anticuerpo debe tener la máxima especificidad para el compuesto activo, doxorrubicina, y presentar una reactividad cruzada muy baja o nula con los metabolitos que no son farmacéuticamente activos de doxorrubicina, particularmente doxorrubicina aglicona que tiene la fórmula:

**(Ver fórmula)**

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

De acuerdo con la presente invención, se ha producido una nueva clase de anticuerpos que son sustancialmente reactivos de forma selectiva con doxorrubicina para unirse a 5 doxorrubicina sin ninguna reactividad cruzada sustancial, es decir, menor del 20 % con metabolitos de doxorrubicina que no son farmacéuticamente activos, particularmente doxorrubicina aglicona. Por reactivo de forma selectiva se entiende que este anticuerpo sólo reacciona con la molécula de doxorrubicina farmacéuticamente activa y no reacciona sustancialmente (es decir, presenta una reacción cruzada menor del 20 %) con los metabolitos

10 de doxorrubicina que no son farmacéuticamente activos, siendo los metabolitos de bloqueo más importantes la doxorrubicina aglicona. Se ha descubierto que mediante el uso de inmunógenos que son conjugados de un vehículo inmunogénico que tiene un grupo funcional tiol o amino reactivo con compuestos de

**(Ver fórmula)**

o, en la que Aes

**(Ver fórmula)**

Y es un grupo espaciador orgánico; X es un grupo funcional capaz de unirse a dicho vehículo a través de dicho grupo amino o tiol; y

p es un número entero de 0 a 1;

o compuestos de fórmula:

**(Ver fórmula)**

en la que p, Y y X son como se ha indicado anteriormente y B es -CH2-o

**(Ver fórmula)**

o mezclas de los mismos; se producen anticuerpos que son específicos para doxorrubicina y no reaccionan sustancialmente (es decir, presentan una reacción cruzada menor del 20 %) con ni se unen a metabolitos que no son farmacéuticamente activos, particularmente doxorrubicina aglicona. La provisión de estos anticuerpos que reaccionan de una forma sustancialmente 10 selectiva con doxorrubicina y no presentan reacción cruzada (es decir, presentan una reacción cruzada menor del 20 % con metabolitos farmacéuticamente inactivos, particularmente doxorrubicina aglicona) permite producir un inmunoensayo que puede detectar específicamente y controlar la doxorrubicina en las muestras de fluido de pacientes que se están tratando con doxorrubicina. También se incluyen dentro de la presente invención reactivos y kits para dicho inmunoensayo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

De acuerdo con la presente invención, se proporciona una nueva clase de anticuerpos que reaccionan de una forma sustancialmente selectiva con doxorrubicina y no reaccionan o presentan reacción cruzada sustancialmente con metabolitos de doxorrubicina farmacéuticamente inactivos mencionados anteriormente en el presente documento (es decir, con una reacción cruzada menor del 20 %). Se ha descubierto que mediante el uso de estos derivados de doxorrubicina 13-oxo sustituidos de fórmula II-A y/o de la doxorrubicina 14-hidroxi sustituida de fórmula II-B o mezclas de los mismos, como inmunógenos, se proporciona esta nueva clase de anticuerpos de la presente invención. Mediante el uso de estos anticuerpos, se ha desarrollado un inmunoensayo, incluyendo reactivos y kits para dicho inmunoensayo para detectar y/o cuantificar la doxorrubicina en sangre, plasma u otras muestras de fluidos corporales. Mediante el uso de este inmunoensayo, puede detectarse y/o cuantificarse la presencia y cantidad de doxorrubicina en muestras de fluido corporal, preferentemente una muestra de sangre o plasma. De esta manera, puede controlarse a un paciente que se está tratando con doxorrubicina durante la terapia y puede ajustarse su tratamiento de acuerdo con dicho control. Por medio de la presente invención, se consigue la monitorización de fármacos terapéuticos de doxorrubicina en pacientes con cáncer que se están tratando con doxorrubicina como agente quimioterapéutico.

Los reactivos usados en el ensayo de la presente invención son conjugados de un vehículo que contiene un grupo tiol o amino reactivo con los compuestos de fórmula...

1. Un inmunoensayo para detectar doxorrubicina en una muestra que comprende proporcionar una mezcla de a) dicha muestra, b) un anticuerpo que es reactivo selectivamente con doxorrubicina y tiene una reactividad cruzada con respecto a doxorrubicina con doxorrubicina aglicona de menos del 20 % y c) un conjugado de un vehículo que tiene un

**(Ver fórmula)**

en la que Aes

=N-O-, o

Y es un grupo espaciador orgánico;

X es un grupo funcional capaz de unirse a dicho vehículo a través de dicho grupo amino o tiol; 15 y

p es un número entero de 0 a 1;

o un compuesto de fórmula:

en la que X, Y y p son como se han definido anteriormente y B es -CH2-o

o una mezcla de los mismos;

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

5 provocando que la doxorrubicina en la muestra y dicho conjugado en dicha mezcla se unan en dicha mezcla con dicho anticuerpo y, después de ello, midiendo la cantidad de dicho conjugado en dicha mezcla que se une o separa de dicho anticuerpo, de manera que puede determinarse la presencia de doxorrubicina en la muestra.

2. Un inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que p es 0 en el compuesto de fórmula II-A y/o el compuesto de fórmula II-B.

3. Un inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que p es 1 en el compuesto de fórmula II-A y/o el compuesto de fórmula II-B.

4. Un inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 3, en el que Y es alquileno que

**(Ver fórmula)**

en los que n y o son números enteros de 0 a 6, y m es un número entero de 1 a 6 en el compuesto de fórmula II-A y/o el compuesto de fórmula II-B.

5. Un inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en el que Y es alquileno que contiene de 1 a 10 átomos de carbono en el compuesto de fórmula II-A y/o el compuesto de fórmula II-B.

6. Un inmunoensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que X es

- N =C =R4,

**(Ver fórmula)**

10 en los que R3 es hidrógeno o se toma junto con el átomo de oxígeno al que está unido para formar un éster reactivo y R4 es oxígeno o azufre en el compuesto de fórmula II-A y/o el compuesto de fórmula II-B.

7. Un inmunoensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en 15 el que X es

**(Ver fórmula)**

y R3 es hidrógeno en el compuesto de fórmula II-A y/o el compuesto de fórmula II-B.

8. Un inmunoensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el 20 que X es

**(Ver fórmula)**

y R3 forma un éster reactivo en el compuesto de fórmula II-A y/o el compuesto de fórmula II-B.

9. Un inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el éster formado es un éster de alquilo inferior, imidoéster o amidoéster en el compuesto de fórmula II-A y/o el compuesto de fórmula II-B.

10. Un inmunoensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que X es un grupo funcional capaz de unirse a un grupo tiol en el compuesto de fórmula II-A y/o el compuesto de fórmula II-B.

11. Un inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 10, en el que X es

**(Ver fórmula)**

en el compuesto de fórmula II-A y/o el compuesto de fórmula II-B.

12. Un inmunoensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en 10 el que la muestra es una muestra humana.

13. Un inmunoensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo se genera a partir de un inmunógeno que comprende un vehículo inmunogénico que tiene un grupo tiol o amino reactivo conjugado con un compuesto de

15 fórmula:

**(Ver fórmula)**

en la que p, X, Y y A son como se han definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o un compuesto de fórmula:

**(Ver fórmula)**

en la que p, Y, X y B son como se han definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o una mezcla de los mismos.

14. Un inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 13, en el que el compuesto conjugado con dicho vehículo inmunogénico para generar los anticuerpos tiene la fórmula:

**(Ver fórmula)**

en la que p, X, Y y A son como se han definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a

11.

15. Un inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 13 o la reivindicación 14, en el que el vehículo contiene un grupo tiol y X en el compuesto que está unido al polímero inmunogénico es un grupo funcional capaz de reaccionar con dicho tiol.

15 16. Un inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 15, en el que X es

**(Ver fórmula)**

17. Un inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 15 o la reivindicación 16, en el que

18. Un inmunoensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en el que el vehículo inmunogénico contiene como grupo funcional

**(Ver fórmula)**

en el que v es un número entero de 1 a 6.

19. Un inmunoensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo está unido a un soporte sólido.

20. Un inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 19, en el que el soporte sólido son placas de microtitulación.

21. Un inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 19, en el que el soporte sólido son 15 nanopartículas.

22. Un anticuerpo que se une selectivamente a doxorrubicina y tiene una reactividad cruzada con respecto a doxorrubicina con doxorrubicina aglicona de menos del 20 %.

23. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 22, en el que dicho anticuerpo se obtiene de ratón, oveja, conejos o ratas.

24. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 22 o la reivindicación 23, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

25. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, en el que dicho anticuerpo es como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18.

26. Un kit para determinar la presencia de doxorrubicina en una muestra de un paciente

30 que comprende reactivos en distintos recipientes, siendo uno de los reactivos un conjugado de un vehículo que contiene un grupo amino o tiol funcional con un compuesto de fórmula:

**(Ver fórmula)**

en la que p, X, Y y A son como se han definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o un compuesto de fórmula:

**(Ver fórmula)**

5 en la que p, Y, X y B son como se han definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o una mezcla de los mismos; y conteniendo el segundo recipiente un anticuerpo que es sustancialmente reactivo de forma selectiva con doxorrubicina y tiene una reactividad cruzada con respecto a doxorrubicina con doxorrubicina aglicona de menos del 20 %.

27. Un kit de acuerdo con la reivindicación 26, en el que dicho conjugado está presente en una cantidad predeterminada en dicho primer recipiente.

28. Un kit de acuerdo con la reivindicación 26 o la reivindicación 27, en el que dicho kit se usa para determinar la cantidad de doxorrubicina en dicha muestra.

29. Un kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28, en el que dicho anticuerpo es como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25.