PROCEDIMIENTO DE FABRICACIÓN DE UN COMPLEJO ENTRE DOXICICLINA Y ALBÚMINA SÉRICA BOVINA Y SU APLICACIÓN A LA FABRICACIÓN DE UN ANTICUERPO ANTIDOXICICLINA.

Procedimiento de fabricación de un complejo de un hapteno y de una molécula porosa entre un derivado de tetraciclina y albúmina sérica bovina por una reacción de Mannich,

caracterizado porque el derivado de la tetraciclina es la doxiciclina y porque el procedimiento comprende las etapas siguientes: a) disolución de la doxiciclina y de la albúmina sérica bovina en presencia de formaldehído a un pH comprendido entre 4 y 5, b) incubación de la mezcla de la etapa precedente a una temperatura comprendida entre 25°C y 50°C durante un periodo igual o superior a 12 horas, c) purificación y aislamiento de la doxiciclina acoplada a la BSA por paso en una columna de desalación de la mezcla de reacción de la etapa precedente

La invención se refiere a la investigación de la doxiciclina en la orina o el plasma humano o animal.

Más en particular, la invención se refiere a la preparación de un hapteno compuesto por doxiciclina unida a albúmina sérica bovina (BSA) para permitir la producción de anticuerpoantidoxiciclina con el fin de detectar la doxiciclina por una reacción inmunológica.

La doxiciclina es un antibiótico de la clase de las tetraciclinas de segunda generación y se usa, sobre todo, para el tratamiento y la quimioprofilaxis antipalúdica.

Se trata de la desoxi-6-hidroxi-5 tetraciclina, de fórmula bruta C22H24N2O8.

Desde 2002, en los ejércitos, la prevención del paludismo resistente a la cloroquina se garantiza en parte por el uso de la doxiciclina a razón de 100 mg al día. Actualmente, la verificación de la observancia de esta quimioprofilaxis se apoya en la implementación de la dosificación en las orinas o el plasma de la doxiciclina mediante técnicas complejas quenecesitan un laboratorio equipado con cromatógrafo líquido de alto rendimiento (HPLC).

Evidentemente, este procedimiento no puede usarse sobre el terreno. Ahora bien, para permitir una gestión adaptada de la molécula, parece indispensable que los médicos de unidad y la dirección dispongan de una prueba inmediata de seguimiento de la toma de doxiciclina.

Existen pruebas inmunológicas en forma de kits para la detección de tetraciclinas, comercializados con la marca RIDASCREEN por la empresa Charm Sciences Inc.

Estas pruebas se basan en el reconocimiento de un antígeno por un anticuerpo.

El antígeno proviene del acoplamiento de la tetraciclinacon una proteína. Sin embargo, la revelación del anticuerpo se hace por medios ópticos y necesita el empleo de un espectrofotómetro. Además, estos kits se limitan a la detección de las tetraciclinas en general con fines alimentarios (en la leche, la miel, la carne) y no están adaptados a una detección sensible en el hombre o el animal.

Finalmente, estos kits sólo permiten administrar ciertastetraciclinas (tetraciclina, clortetraciclina, minociclina,rolitetraciclina, oxitetraciclina), pero no doxiciclina. En el Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 1980,217, 1, 10-14, Bahjat A., Faraj y Farouk M. Ali describen un antisuero contra la tetraciclina producido en conejosinmunizados por un hapteno formado por tetraciclina conjugado con BSA. Este antisuero es muy selectivo, por lo cual secundariamente sólo reacciona con la clortetraciclina y sureactividad secundaria con otras tetraciclinas, entre ellas la doxiciclina, es insignificante (1%). La detección se realiza por marcado radioactivo de las moléculas.

El hapteno se prepara por una reacción de Mannich, poniendo en contacto tetraciclina con BSA, en presencia de formaldehído.

Se sabe aplicar la reacción de Mannich a compuestos de la familia de las tetraciclinas, cuya estructura general se representa en la fig. 1 a continuación, haciéndolos reaccionar con formaldehído y aminoácidos. La patente estadounidense

3.042.716 describe derivados aminoalquilados obtenidos porsimple puesta en contacto en medio acuoso y a temperaturaambiente de estos compuestos con formaldehído y un aminoácido como, por ejemplo, lisina. Las tetraciclinas tienen en común un esqueleto de naftaceno constituido por 4 ciclos bencénicos (A, B, C, D). La alquilación tiene lugar en el grupo amida situado en posición 2 del ciclo A. Estos nuevos compuestos presentan una mejor solubilidad y una mejor absorción gastrointestinal.

Por el contrario, en la publicación de Bahjat y col., el átomo de hidrógeno situado en posición 9 del ciclo D es el que está implicado en la reacción.

Está indicado que en la especificidad del antisuero resultante influyen diversos factores, como el tamaño del puente entre el hapteno y la proteína portadora, los grados de libertad del sitio de enlace del hapteno. La reactividad del anticuerpo con respecto a otros compuestos de la familia de las tetraciclinas por sustituyentes en el núcleo es directamente proporcional a su proximidad con la del hapteno. La mayorafinidad del anticuerpo por el hapteno corresponde a la zona más alejada del sitio de unión de la proteína. La introducción de un grupo hidroxilo en posición 5 del núcleo B, como en la doxiciclina (desoxi-6-hidroxi-5 tetraciclina), cuya fórmula desarrollada se representa en la fig. 2 más adelante, reduce considerablemente la afinidad de estos compuestos por el anticuerpo. El objeto de la presente invención es la puesta a punto de un procedimiento de identificación de la doxiciclina en la orina o el plasma del hombre o el animal que pueda usarse sin necesitar de aparatos complejos, y que sea rápido, específico, sensible y poco oneroso.

Para ello, se ha tenido la idea de crear un compuestoantigénico capaz de inducir la producción de anticuerpoantidoxiciclina. La invención tiene por objeto un procedimiento de fabricación de un hapteno entre un derivado de tetraciclina y albúmina sérica bovina mediante una reacción de Mannich,caracterizado porque el derivado de la tetraciclina es doxiciclina y porque el procedimiento comprende las etapassiguientes:

a) disolución de la doxiciclina y de la albúmina sérica bovina en presencia de formaldehído a un pH comprendido entre 4 y 5,

b) incubación de la mezcla de la etapa precedente a una temperatura comprendida entre 25°C y 50°C durante una duración igual o superior a 12 horas,

c) purificación y aislamiento de la doxiciclina acoplada a la BSA mediante paso en una columna de desalación de la mezcla de reacción de la etapa precedente.

Según una forma de realización optimizada, la incubación se efectúa a una temperatura de 40°C durante 12 horas. La etapa a) se realiza a un pH de 4,7.

La invención tiene igualmente por objeto el uso del hapteno fabricado según la invención para la identificación de ladoxiciclina en la orina del hombre o el animal.

Como se indica en el artículo de Bahjat y col. citado anteriormente, en las mismas condiciones experimentales, la identificación, por este procedimiento, de la doxiciclina es 100 veces menos sensible en relación con la sensibilidad de la tetraciclina.

Por tanto, ha sido necesario poner a punto las condiciones de funcionamiento particulares, como la acidez del medio y la temperatura, para obtener un rendimiento de acoplamiento entre la doxiciclina y la BSA aceptable. El rendimiento de acoplamiento se ha estimado mediante la dosificación de la doxiciclina libre antes y después del acoplamiento.

La doxiciclina posee un hidrogeno reactivo en la posición 9 del ciclo D. Este último puede reaccionar con un aminoácido en presencia de formaldehído según una reacción de Mannich. La reacción tiene lugar en particular con los residuos de lisina presentes en gran número (9% de los aminoácidos) de la BSA. Se obtiene así un polímero de doxiciclina-BSA.

Este polímero es una estructura antigénica capaz de inducir la producción de anticuerpos específicos antidoxiciclina. Lainvención se comprenderá mejor con ayuda de los siguientes ejemplos de realización.

Ejemplo de fabricación de un hapteno doxiciclina-BSA según la invención:

Se usan 2 mg de BSA catiónica liofilizada rica en lisina conocida con la denominación comercial SuperCarrier Immune Modulator fabricado por la empresa PIERCE.

Se disuelve este liofilizado en 200 l de agua ultrapuraMilliQ® fabricada por la empresa Millipore. Se obtiene una solución de BSA a 10 mg/l que contiene MES [Ácido (N-morfolino)2-etanosulfónico] 0,1 M, NaCl 0,15 M, agentes de estabilización, a pH 4,7.

Se disuelven 5 mg de clorhidrato de doxiciclina fabricado por la empresa SIGMA en 200 l de una solución de tampón deenlace que comprende MES 100 M, NaCl 0,15 M, de pH 4,7.

Se mezclan los 200 l de BSA con los 200 l de doxiciclina.

Se añaden a la mezcla 50 l de una solución que contiene el37% de formaldehído fabricada por la empresa SIGMA.

Se incuba la mezcla de reacción a 40°C durante 12 horas.

Se usa una columna de desalación D-Salt® Dextran Plastic Desalting Column fabricada por la empresa PIERCE y se equilibra con 5 ml de una solución de tampón de purificación que contiene PBS 6 mM, NaCl 150 mM, de pH 7,2.

Se deposita... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de fabricación de un complejo de un hapteno y de una molécula porosa entre un derivado de tetraciclina y albúmina sérica bovina por una reacción de Mannich,caracterizado porque el derivado de la tetraciclina es la doxiciclina y porque el procedimiento comprende las etapassiguientes:

a) disolución de la doxiciclina y de la albúmina sérica bovina en presencia de formaldehído a un pH comprendido entre 4 y 5,

b) incubación de la mezcla de la etapa precedente a unatemperatura comprendida entre 25°C y 50°C durante un periodo igual o superior a 12 horas,

c) purificación y aislamiento de la doxiciclina acoplada a la BSA por paso en una columna de desalación de la mezcla de reacción de la etapa precedente.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la incubación se efectúa a una temperatura de 40°C durante 12 horas.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque la etapa a) se realiza a un pH de 4,7.

4. Uso de un complejo de un hapteno y de una molécula portadora fabricado según las reivindicaciones 1 a 3 para la producción de un anticuerpo antidoxiciclina que permite,mediante una reacción inmunológica, la identificación de ladoxiciclina en la orina o el plasma del hombre o el animal.

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**