MÉTODO DE CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD DE ANTITROMBINA !!!.

Una columna de cromatografía de actividad que comprende la proteína antitrombina III (ATIII) enlazada a un soporte sólido,

caracterizada porque : a. la proteína ATIII es la proteína salvaje o una variante de ésta, b. la proteína ATIII se ha activado previamente por incubación con una heparina de bajo peso molecular (HBPM) no modificada y rica en especies activas, c. la proteína ATIII está enlazada de forma covalente a una resina en una proporción inferior a aproximadamente 2 mg de proteína por mL de resina hidratada

La presente invención tiene por objeto una columna de cromatografía de afinidad que comprende la proteína ATIII asociada a un soporte sólido.

Las heparinas, mezclas de mucopolisacáridos sulfatados de origen animal, son agentes biológicamente activos de la familia de los glicosaminoglicanos que tienen propiedades anticoagulantes particularmente útiles. Están constituidas por cadenas lineales polisacarídicas sulfatadas, muy heterogéneas con respecto a su tamaño. El peso medio de las heparinas es de aproximadamente 15000 Da (origen : mucus de cerdo).

Las heparinas de bajo peso molecular (HBPM) y las heparinas de muy bajo peso molecular (HMBPM) se preparan por corte de las cadenas polisacarídicas largas de heparina en cadenas más cortas de bajo peso molecular. Se entienden también por HBPM y HMBPM cadenas cuyo peso molecular está comprendido respectivamente entre 3000 y 6500 Da y entre 1500 y 3000 Da.

La Antitrombina III (ATIII) (Chandra et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80 : 1845-1848) es una serpina específica, que posee una débil actividad inhibidora de las serina proteasas que controlan la coagulación. Esta acción se ve nítidamente aumentada en presencia de heparina, que se enlaza y activa la ATIII. En particular, el enlace con la heparina implica un conjunto de cambios conformacionales en la proteína que culminan con la adopción de una conformación altamente favorable a la interacción con las serinas proteasas diana. Cuando la ATIII está en la conformación activada, la interacción con la molécula de heparina o derivada que ha iniciado el cambio en la conformación se ve nítidamente reforzada.

La interacción entre la heparina y la ATIII se debe a una secuencia pentasacarídica específica. Ahora bien, sólo un tercio de las hebras polisacarídicas poseen las secuencias específicas que permiten una interacción estable con la ATIII. Las preparaciones de heparina y derivados son, por tanto, heterogéneas en lo que se refiere a la afinidad por la ATIII. Es importante poder enriquecer una población de oligosacáridos en especies afines a la ATIII, siendo tal enriquecimiento susceptible de aumentar significativamente la actividad anticoagulación de esta población.

En el documento de Höök et al. (1976, FEBS Lett., 66 : 90-93) se describe un método de cromatografía de afinidad hacia ATIII para separar las fracciones afines y no afines de la heparina. 90-93). Se han publicado otros métodos, si bien repiten los puntos esenciales del método de Höök et al. (Hopwood et al., 1976, FEBS Lett., 69 : 51-54; Denton et al., 1981, Anal. Biol., 118: 388-391; Pixley & Danishefsky, 1982, Thromb. Res., 26 : 129-133). Según este método, la ATIII se fija covalentemente, en presencia de heparina acetilada, sobre la resina Sepharose B activada con CNBr. La utilización de heparina tiene como finalidad prevenir toda fijación covalente de la ATIII vía el sitio de enlace a la heparina.

Esta técnica tiene dos limitaciones importantes.

En primer lugar, la heparina utilizada para enlazarse a la ATIII es una heparina acetilada, de forma que se evita el riesgo de competición con los restos NH2 de las hexaminas. Ahora bien, la acetilación de la heparina se traduce en una disminución importante de su afinidad y, por tanto, de su poder protector con respecto al sitio de enlace, de donde se deduce una disminución del número de moléculas de ATIII capaces de enlazarse con las especies afines.

Por otra parte, en vista de la concentración de ATIII utilizada (aproximadamente 7 mg de proteína/mL de resina hidratada), existe un fuerte riesgo de impedimento estérico entre las moléculas de polisacáridos susceptibles de enlazarse a la ATIII cuando se efectúa una purificación de especies afines hacia ATIII.

La presente invención tiene como objeto una columna de cromatografía de afinidad que comprende la proteína antitrombina III (ATIII) enlazada a un soporte sólido, caracterizada porque :

a. la proteína ATIII es la proteína salvaje o una variante de ésta,

b. la proteína ATIII se ha activado previamente por incubación con una heparina de bajo peso molecular (HBPM) no modificada y rica en especies activas,

c. la proteína ATIII está enlazada de forma covalente a una resina en una proporción inferior a aproximadamente 2 mg de proteína por mL de resina hidratada.

Se entiende por HBPM no modificada una HBPM que no ha sufrido modificación química ni enzimática después de su preparación y, en particular, que no está acetilada. Se entiende por HBPM rica en especies activas una HBPM rica en oligosacáridos afines hacia la ATIII.

Según la invención, se entiende por resina un soporte macromolecular químicamente inerte sobre el que se fija covalentemente la ATIII. Estos soportes comprenden, entre otros y de forma no limitante, bolas de agarosa, poli(acrilamida) de agarosa, vidrio poroso, polivinilo o polimetacrilato, sobre los cuales se fija la ATIII covalentemente siguiendo las indicaciones de los fabricantes o métodos muy conocidos por los expertos en la materia, en particular los métodos de fijación covalente con bromuro de cianógeno e hidrazina. Se sobreentiende que pueden también utilizarse resinas preactivadas.

Según un modo muy particularmente ventajoso de realización de la invención, la resina utilizada es Sepharose y la técnica de fijación covalente utilizada es la de fijación covalente con bromuro de cianógeno.

La columna de cromatografía de afinidad según la invención presenta una doble ventaja.

Por una parte, la utilización de una HBPM no modificada para proteger el sitio de enlace de la ATIII permite fijar la proteína bajo una conformación activada. Bajo esta conformación, la ATIII presenta una afinidad significativamente más fuerte y más selectiva con respecto a especies afines que las ATIII enlazadas vía las aminas primarias sin activación previa.

Por otra parte, la baja concentración de ATIII permite interacciones con las especies afines sin impedimento estérico entre ellas. Esta propiedad de la invención es particularmente interesante cuando se busca separar especies de gran tamaño.

Para que todas las moléculas de ATIII sean activadas, es preferible utilizar una cantidad saturante de HBPM no modificada y rica en especies afines.

Según una forma de realización ventajosa de la invención, la razón entre las cantidades de sitios de enlace con la ATIII presentes en la HBPM y de moléculas de ATIII está comprendida entre aproximadamente 5 y aproximadamente 15. Más precisamente, la invención tiene como objeto una columna de cromatografía de afinidad, tal como se ha definido anteriormente, caracterizada porque esta razón es de aproximadamente 10.

La invención tiene muy particularmente como objeto una columna de cromatografía de afinidad caracterizada porque para proteger el sitio de enlace de la ATIII se utiliza enoxaparina® como HBPM.

Como se ha explicado anteriormente, la invención presenta también la ventaja de permitir una mejor accesibilidad a la ATIII al manejar la concentración de proteína covalentemente fijable sobre la resina.

Según otra forma de realización ventajosa, la invención tiene como objeto una columna de cromatografía de afinidad caracterizada porque la razón ATIII/resina está comprendida entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 1,5 mg de proteína por mL de resina. Por ejemplo, para una resina de tipo Sepharose B activada mediante bromuro de cianógeno (Sigma), dicha razón corresponde a una gama de aproximadamente 1,75 mg a 5,25 mg de proteína por g de resina seca (según los datos del proveedor, 1 g de resina seca da aproximadamente 3,5 mL de resina después de su hidratación).

Así, la columna de cromatografía de afinidad según la invención presenta una mayor capacidad y una mayor selectividad que las columnas descritas en el estado de la técnica.

Existen situaciones en las que se puede desear purificar especies afines a la ATIII a partir de una mezcla de especies afines y no afines. Se entiende por especie afín a la ATIII toda molécula susceptible de enlazarse específicamente a la ATIII. Por ejemplo, se puede querer enriquecer en especies afines una población de oligosacáridos heparínicos. También puede ser interesante, por ejemplo, aumentar la concentración de una disolución de anticuerpos policlonales contra ATIII.

Así, la columna de cromatografía de afinidad según la invención puede utilizarse para purificar especies... [Seguir leyendo]

1. Una columna de cromatografía de actividad que comprende la proteína antitrombina III (ATIII) enlazada a un soporte sólido, caracterizada porque :

a. la proteína ATIII es la proteína salvaje o una variante de ésta,

b. la proteína ATIII se ha activado previamente por incubación con una heparina de bajo peso molecular (HBPM) no modificada y rica en especies activas,

c. la proteína ATIII está enlazada de forma covalente a una resina en una proporción inferior a aproximadamente 2 mg de proteína por mL de resina hidratada.

2. Una columna tal como se ha definido en la reivindicación 1, caracterizada porque la razón entre las cantidades de sitios de enlace con la ATIII presentes en la HBPM y de moléculas de ATIII está comprendida entre aproximadamente 5 y aproximadamente 15.

3. Una columna tal como se ha definido en la reivindicación 2, caracterizada porque dicha razón es de aproximadamente 10.

4. Una columna tal como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la HBPM es la enoxaparina®.

5. Una columna tal como se ha definido en la reivindicación 1, caracterizada porque la razón ATIII/resina está comprendida entre 0,5 y 1,5 mg de proteína por mL de resina.

6. Un procedimiento de purificación de las especies afines a la ATIII contenidas en una muestra que comprende especies afines y no afines a la ATIII, comprendiendo dicho procedimiento :

a. la introducción de dicha muestra en la columna de cromatografía de afinidad según la reivindicación 1, habiendo sido dicha columna previamente equilibrada con un tampón salino apropiado ;

b. el lavado de las especies no específicamente retenidas en dicha columna mediante un tampón salino de lavado apropiado ; y

c. la elución de las especies específicamente retenidas en dicha columna mediante un tampón salino de elución apropiado.

7. Un procedimiento de purificación de las especies afines a la ATIII según la reivindicación 6, caracterizado porque dichas especies son oligosacáridos.