MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS RELACIONADOS CON LA AGREGACIÓN DE PROTEÍNAS EN LA ENFERMEDAD NEURODEGENERATIVA.

Un procedimiento para convertir proteolíticamente una proteína precursora en un fragmento producto en una línea celular estable,

dicha proteína precursora está asociada con un estado de enfermedad en el que la proteína precursora se agrega patológicamente, procedimiento que comprende: (a) proporcionar una línea celular estable transfectada con un ácido nucleico que codifica: (i) un fragmento de plantilla de la proteína precursora tal que el fragmento de plantilla se exprese constitutivamente en la célula a un nivel que no sea tóxico para la célula; y (ii) la proteína precursora, proteína que es expresada de forma inducible en la célula en respuesta a un estímulo, (b) someter la célula al estímulo tal que exprese de forma inducible la proteína precursora en la célula, por lo que la interacción del fragmento de plantilla con la proteína precursora causa un cambio conformacional en la proteína precursora de forma que causa una agregación y procesado proteolítico de la proteína precursora del fragmento producto

Campo técnico [0001] La presente invención se refiere a modelos basados en células y a otros sistemas de análisis para modelar la agregación de proteínas asociada con la enfermedad neurodegenerativa. Adicionalmente se refiere a compuestos capaces de modular dicha agregación.

Antecedentes de la técnica [0002] Los estados de demencia tales como la enfermedad de Alzheimer (AD) se caracterizan frecuentemente por una acumulación progresiva de depósitos intracelulares y/o extracelulares de estructuras proteicas tales como placas β-amiloides y marañas neurofibrilares en el cerebro de los pacientes afectados. El aspecto de estas lesiones se correlaciona en su mayor parte con una degeneración neurofibrilar patológica y una atrofia cerebral, así como con un deterioro cognitivo (Mukaetova-Ladinska, E. B. y col. (2000) Am. J. Pathol. Vol. 157, Nº 2, 623-636). [0003] Tanto las placas neuríticas como las marañas neurofibrilares contienen filamentos helicoidales apareados (PHF), de los que un constituyente principal es la proteína tau asociada a microtúbulos (Wischik y col. (1988) PNAS EE.UU. 85, 4506). Las placas también contienen fibrillas β-amiloides extracelulares derivadas de un procesado anormal de la proteína precursora amiloidea (APP; Kang y col. (1987) Nature 325, 733). Un artículo de Wischik y col. (en 'Neurobiology of Alzheimer's Disease', 2ª Edición (2000) Eds. Dawbarn, D. y Allen, S. J., The Molecular and Cellular Neurobiology Series, Bios Scientific Publishers, Oxford), discute con detalle el papel putativo de la proteína tau en la patogenia de las demencias neurodegenerativas. [0004] Los estudios de la enfermedad de Alzheimer indican que la pérdida de la forma normal de la tau (Mukaetova-Ladinska y col. (1993) Am. J. Pathol., 143, 565; Wischik y col. (1995a) Neurobiol. Ageing, 16: 409; Lai y col. (1995b) Neurobiol. Ageing, 16: 433), la acumulación de PHFs patológicos (Mukaetova-Ladinska y col. (1993), loc. cit.; Harrington y col. (1994a) Dementia, 5, 215; Harrington y col. (1994b) Am. J. Pathol., 145, 1472; Wischik y col., (1995a), loc. cit.) y la pérdida de sinapsis en la corteza mesofrontal (Terry y col. (1991) Ann. Neurol., 30, 572) se correlacionan con un deterioro cognitivo asociado. Adicionalmente, la pérdida de sinapsis (Terry y col., loc. cit.) y la pérdida de células piramidales (Bondareff y col. (1993) Arch. Gen. Psychiatry, 50: 350) se correlacionan ambas con medidas morfométricas de una patología neurofibrilar reactiva a tau, que es semejante, a un nivel molecular, a una

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redistribución prácticamente total del conjunto de proteínas tau desde una forma soluble a una polimerizada (PHFs) en la enfermedad de Alzheimer (Mukaetova-Ladinska y col. (1993), loc. cit.; Lai y col. (1995), loc. cit.). [0005] La tau existe en isoformas de corte y empalme alternativo, que contienen tres o cuatro copias de una secuencia repetitiva correspondiente al dominio de unión a microtúbulos (Goedert, M., y col. (1989) EMBO J. 8, 393-399; Goedert, M., y col. (1989) Neuron 3, 519-526). La tau de los PHF se procesa proteolíticamente a un dominio de núcleo (Wischik, C. M., y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85, 4884-4888; Wischik y col. PNAS EE.UU. 1988, 85: 4506-4510); Novak, M., y col. (1993) EMBO J. 12, 365-370) que está formado por la versión de fase alterna del dominio repetitivo; sólo hay tres repeticiones implicadas en la integración estable tautau (Jakes, R., y col. (1991) EMBO J. 10, 2725-2729). Una vez formados, los agregados de tau de tipo PHF actúan como semillas para la captura adicional y proporcionan un plantilla para el procesado de la proteína tau completa (Wischik y col. 1996 Proc Natl Acad Sci EE.UU. 93, 11213-11218). [0006] En el transcurso de su formación y acumulación, los filamentos helicoidales apareados (PHFs) se agrupan en primer lugar para formar agregados amorfos dentro del citoplasma, probablemente a partir de oligómeros tempranos de tau que quedan truncados antes o en el transcurso de la agrupación de los PHF (Mena, R., y col. (1995) Acta Neuropathol. 89, 50-56; Mena, R., y col. (1996) Acta Neuropathol. 91, 633-641). Estos filamentos continúan entonces para formar unas clásicas marañas neurofibrilares intracelulares. En este estado, los PHF están constituidos por un núcleo de tau truncada y una cubierta exterior y difusa que contiene la tau completa (Wischik.,

C. M., y col, (1996) loc. cit.). El proceso de agrupación es exponencial, consumiendo el conjunto celular de tau funcional normal e induciendo una nueva síntesis de tau para compensar el déficit (Lai, R. Y. K., y col., (1995), Neurobiology of Ageing, Vol. 16, Nº 3, 433-445). Finalmente, el deterioro funcional de la neurona progresa hasta el punto de la muerte celular, dejando atrás una maraña extracelular. La muerte celular se correlaciona en gran medida con el número de marañas extracelulares (Wischik y col. 2000, loc. cit). Dado que las marañas son empujadas hacia el espacio extracelular, hay una pérdida progresiva de la cubierta exterior difusa de la neurona-PHF con la correspondiente pérdida de la inmunorreactividad tau N-terminal, pero conservando la inmunorreactividad de la tau asociada con el núcleo de los PHF (Figura 1; también Bondareff, W. y col., (1994) J. Neuropath. Exper. Neurol., vol. 53, Nº 2, 158-164). [0007] El cambio de fase que se observa en el dominio repetitivo de la tau

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incorporada en los PHF sugiere que el dominio repetitivo experimenta un cambio conformacional inducido durante la incorporación en el filamento. Al inicio de la enfermedad de Alzheimer, se contempla que este cambio conformacional podría iniciarse por la unión de la tau a un sustrato patológico, tal como proteínas de membrana dañadas o mutadas (véase la Figura 2 - también Wischik, C. M., y col. (1997) en "Microtubule-associated proteins: modifications in disease", eds. Avila, J., Brandt, R. y Kosik, K. S. (Harwood Academic Publishers, Amsterdam) págs. 185241). [0008] En el caso de la enfermedad de Alzheimer, las terapias farmacéuticas actuales se centran en el tratamiento sintomático de la pérdida de la transmisión colinérgica resultante de la neurodegeneración (Mayeux, R., y col. (1999) New Eng. J. Med. 341, 1670-1679). Sin embargo, aunque los tratamientos disponibles retrasan la progresión de la enfermedad en hasta 6 a 12 meses, no la previenen. El descubrimiento de fármacos que podrían impedir la agregación de la tau que da lugar a la neurodegeneración proporcionaría una estrategia más efectiva para la profilaxis o para la inhibición de la progresión de la enfermedad, que no requería un conocimiento inmediato de los diversos eventos que, cascada arriba, inician la agregación (véase la Figura 3).

Modelos y ensayos

El documento WO99/62548 (inventores Ghetti y col.) se refiere de forma general a procedimientos y composiciones considerados adecuados para el diagnóstico, modelado y tratamiento de patologías relacionadas con la tau. Se refiere particularmente a mutaciones en el gen de la tau consideradas conductoras a la formación de marañas neurofibrilares, y más específicamente con mutaciones génicas consideradas conductoras a alteraciones en las proporciones de las isoformas de la tau y a la formación de filamentos de tau anormales. [0010] El documento WO96/30766 describe un ensayo in vitro para la agregación de la tau en el que un fragmento de la tau correspondiente al dominio repetitivo del núcleo, que ha sido adsorbido sobre un sustrato en fase sólida, es capaz de capturar la tau soluble completa y unirse a la tau con una elevada afinidad (véase la Figura 4). Esta asociación confiere estabilidad frente a la digestión de las proteasas de las moléculas de tau en los dominios repetitivos de las moléculas de tau que se han agregado. Este proceso es autopropagante y puede ser bloqueado selectivamente mediante agentes farmacéuticos prototipo ((Wischik y col. 1996 Proc Natl Acad Sci EE.UU. 93, 11213-11218).

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Aunque el ensayo in vitro descrito en el documento WO96/30766 facilita la identificación de inhibidores o moduladores de la asociación tau-tau, los presentes inventores también han reconocido que podrían ser útiles los modelos basados en células de la agregación de proteínas del tipo de la enfermedad de Alzheimer. Dichos modelos celulares podrían usarse tanto en el cribado primario de los candidatos moduladores de la agregación tau-tau, como en el cribado secundario de compuestos ya identificados en el ensayo in vitro del documento WO96/30766. Adicionalmente, la demostración de la agregación de la tau en células también podría ayudar en la identificación de los sustratos celulares normales que están...

1. Un procedimiento para convertir proteolíticamente una proteína precursora en un fragmento producto en una línea celular estable, dicha proteína precursora está asociada con un estado de enfermedad en el que la proteína precursora se agrega patológicamente, procedimiento que comprende:

(a) proporcionar una línea celular estable transfectada con un ácido nucleico que codifica:

(i) un fragmento de plantilla de la proteína precursora tal que el fragmento de plantilla se exprese constitutivamente en la célula a un nivel que no sea tóxico para la célula; y

(ii) la proteína precursora, proteína que es expresada de forma inducible en la célula en respuesta a un estímulo,

(b) someter la célula al estímulo tal que exprese de forma inducible la proteína precursora en la célula, por lo que la interacción del fragmento de plantilla con la proteína precursora causa un cambio conformacional en la proteína precursora de forma que causa una agregación y procesado proteolítico de la proteína precursora del fragmento producto.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que la agregación patológica in vivo conduce a un procesado proteolítico de la proteína precursora en un estado de enfermedad asociado con la neurodegeneración y/o la demencia clínica.

3. Un procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la agregación patológica de la proteína precursora en el estado de enfermedad conduce al procesado proteolítico de un fragmento de dominio del núcleo, y el fragmento de plantilla comprende al menos el fragmento de núcleo de la proteína de plantilla.

4. Un procedimiento según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que se produce una pluralidad de diferentes fragmentos producto.

5. Un procedimiento según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que se sigue la producción de al menos un fragmento producto.

6. Un procedimiento para identificar un modulador de la agregación y/o el procesado proteolítico de la proteína precursora asociada con el estado de enfermedad, procedimiento que comprende:

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(a) proporcionar un agente sospechoso de ser capaz de modular la agregación,

(b) realizar un procedimiento según la reivindicación 5 en presencia del agente,

(c) correlacionar la producción del o de cada fragmento producto seguido con la actividad moduladora del agente.

7. Un procedimiento según la reivindicación 6, en el que la etapa (b) se realiza:

(a) cultivando las células en una o más placas,

(b) incubando las células con el agente durante un periodo de tiempo suficiente para que el agente entre en las células.

8. Un procedimiento según la reivindicación 6 o la reivindicación 7 en el que la producción del o de cada fragmento producto seguido se compara con un valor de referencia, en el que el valor de referencia se obtiene al realizar el procedimiento en ausencia del agente.

9. Un procedimiento según la reivindicación 4 en el que la proteína precursora es una proteína tau.

10. Un procedimiento según la reivindicación 9 en el que el fragmento de plantilla comprende un fragmento de tau que se extiende entre los aminoácidos 186297 a 390-441 de la proteína tau completa mostrada en la Fig. 7.

11. Un procedimiento según la reivindicación 10 en el que el fragmento de plantilla consiste en un fragmento de tau que se extiende desde los aminoácidos 295, 296 ó 297 hasta los restos de aminoácidos 390 ó 391 de la proteína tau completa mostrada en la Fig. 7.

12. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 en el

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que se sigue la producción de un fragmento producto de tau de aproximadamente 12, 14, 25, 27, 30, 32, 36, 38, 42 ó 44 kDa.

13. Un procedimiento según la reivindicación 12 en el que se sigue la producción de un fragmento producto de tau de aproximadamente 12 kDa.

14. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13 en el que se sigue la producción del o de cada fragmento producto tóxico en SDS PAGE.

15. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14 en el que se sigue la producción del o de cada fragmento producto tóxico inmunológicamente.

16. Un procedimiento según la reivindicación 15 en el que el seguimiento emplea un anticuerpo seleccionado a partir de un anticuerpo monoclonal que (i) es específico para un epítopo específico humano localizado en la región entre la Gly-16 y la Gln-26 de la tau; (ii) es específico para el fragmento de núcleo de tau truncado en la Glu-391; (iii) es específico para un epítopo genérico de tau en el dominio de repetición; o (iv) es específico para un epítopo genérico de tau no específico de especie localizado entre la Ser-208 y la Ser-238.

17. Un procedimiento para el cribado de un medicamento para uso como agente terapéutico o pronóstico para el tratamiento de una tauopatía, procedimiento que comprende

(a) realizar un procedimiento según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 16,

(b) seleccionar moduladores con un índice terapéutico de más de 2.

18. Un procedimiento para producir una célula estable para su uso en un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que una proteína precursora puede convertirse proteolíticamente en un fragmento producto cuando dicha línea celular se somete a un estímulo, dicha proteína precursora está asociada con un estado de enfermedad en el que la proteína precursora se agrega patológicamente, dicho procedimiento comprende las etapas de introducir en una célula un ácido

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nucleico que codifica para (i) un fragmento de plantilla de la proteína precursora tal que el fragmento de plantilla se expresa constitutivamente en la célula a un nivel que no es tóxico para la célula; y (ii) la proteína precursora tal que la proteína patológica sea expresada de forma inducible en la célula en respuesta al estímulo.

19. Un procedimiento según la reivindicación 18 en el que el ácido nucleico que codifica la proteína precursora está unido operativamente a un promotor inducible lac y en el que el ácido nucleico que codifica para el fragmento de plantilla está unido operativamente a una secuencia promotora de un citomegalovirus.

20. Un procedimiento según la reivindicación 18 o la reivindicación 19 en el que el ácido nucleico que codifica el fragmento de plantilla se introduce como un vector de plantilla, y el ácido nucleico que codifica la proteína precursora se introduce como un vector de proteína precursora por separado.

21. Un procedimiento según la reivindicación 20 en el que el vector de la proteína precursora deriva del vector pOPRSVICAT en el que se clona el ácido nucleico que codifica la proteína precursora, y el vector del fragmento de plantilla deriva del vector del plásmido pZeo295-391 en el que se clona el ácido nucleico que codifica la proteína precursora.

22. Un procedimiento según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21 en el que la proteína precursora es tau.

23. Un procedimiento según la reivindicación 22 en el que el ácido nucleico que codifica el fragmento de plantilla codifica un fragmento de núcleo de tau.

24. Un procedimiento según la reivindicación 23 en el que el ácido nucleico que codifica el fragmento de plantilla codifica un fragmento de tau que se extiende desde los aminoácidos 186-297 hasta los 390-441 de la proteína completa.

25. Un procedimiento según la reivindicación 24 en el que el ácido nucleico que codifica el fragmento de plantilla codifica un fragmento de tau que se extiende desde los aminoácidos 295, 296 ó 297 hasta los restos de aminoácidos 390 ó 391 de la proteína tau completa mostrada en la Fig. 7.

26. Un procedimiento según la reivindicación 25 en el que el ácido nucleico que codifica el fragmento de plantilla codifica un fragmento de tau que se extiende entre los restos de aminoácidos 295 a 391 según se muestra en la Fig. 7.

27. Una célula hospedadora de mamífero en la que una proteína precursora puede convertirse proteolíticamente en un fragmento producto cuando dicha línea celular se somete a un estímulo, Dicha proteína precursora está asociada con un estado de enfermedad en el que la proteína precursora se agrega patológicamente, en el que dicha célula hospedadora de mamífero se transforma con un ácido nucleico que codifica:

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(i) un fragmento de plantilla de una proteína precursora, en el que el fragmento de plantilla se expresa constitutivamente a un nivel que no es tóxico para la célula; y

(ii) la proteína precursora tal que la proteína patológica se expresa de forma inducible en respuesta a un estímulo.

28. Una célula según la reivindicación 27 que es de una línea celular neuronal

o una línea celular de fibroblastos, seleccionada opcionalmente a partir de las siguientes líneas celulares: 3T3; NIE-115; 3T6; N2A; SY5Y; COS-7.

29. Una célula según la reivindicación 27 o la reivindicación 28 en la que la proteína precursora es tau.

30. Una célula según la reivindicación 29 en la que el ácido nucleico que codifica el fragmento de plantilla codifica un fragmento de núcleo de tau.

31. Una célula según la reivindicación 30 en la que el ácido nucleico que codifica el fragmento de plantilla codifica un fragmento de tau que se extiende desde entre los aminoácidos 186-297 hasta 390-441 de la proteína completa.

32. Una célula según la reivindicación 31 en la que el ácido nucleico que codifica el fragmento de plantilla codifica un fragmento de tau que se extiende desde

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los aminoácidos 295, 296 ó 297 hasta los restos de aminoácidos 390 ó 391 de la proteína tau completa mostrada en la Fig. 7.

33. Una célula según la reivindicación 32 en la que el ácido nucleico que

5 codifica el fragmento de plantilla codifica un fragmento de tau que se extiende los restos de aminoácidos 295 a 391 según se muestra en la Fig. 7.

34. Un kit que comprende una célula hospedadora según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 33 junto a al menos un componente adicional

10 seleccionado entre: un agente para estimular la producción de la proteína precursora o un agente para detectar la interacción de la proteína precursora con el fragmento de plantilla.

35. Un kit según la reivindicación 34 en el que el agente de detección es un 15 anticuerpo.