MARCADORES GENETICOS PARA EL PRONOSTICO DE LA ESCLEROSIS MULTIPLE.

La presente invención se relaciona con una serie de genes cuya expresión se ve alterada en sujetos que sufren esclerosis múltiple con respecto a sujetos sanos o en sujetos que sufren esclerosis múltiple de buen pronóstico con respecto a sujetos que sufren esclerosis múltiple de mal pronóstico.

A partir de un conjunto inicial de genes que mostraban dicha expresión diferencial, se ha validado un subconjunto formado por 13 genes y dos variables clínicas que permite predecir la evolución de un paciente con una alta fiabilidad. A partir de dichos valores de expresión, la invención proporciona métodos para pronosticar la evolución de un paciente diagnosticado de esclerosis múltiple a partir de tablas de probabilidad condicionada entre los niveles de expresión de un determinado gen o grupo de genes y las probabilidades de que el paciente tenga un buen o mal pronóstico de la enfermedad

Marcadores genéticos para el pronóstico de la esclerosis múltiple.

Campo técnico de la invención

La invención se relaciona con un método para el pronóstico de la esclerosis múltiple y, más concretamente, con un método para predecir la evolución clínica de pacientes diagnosticados con esclerosis múltiple mediante el análisis de los niveles de expresión de una serie de genes.

Antecedentes de la invención

La esclerosis múltiple (EM) tiene una prevalencia de alrededor de 70 casos cada 100.000 habitantes en España y en el mundo occidental es la causa más común de discapacidad neurológica crónica en adultos jóvenes tras los accidentes de tráfico. Aproximadamente, un 70% de casos debuta entre los 20 y 40 años de edad, con un pico en la edad de inicio alrededor de los 25 o 30 años, por lo que resulta fácilmente comprensible el gran impacto que ocasiona sobre la vida profesional, familiar y social de los afectados, así como el enorme gasto económico y social que genera, similar al de la enfermedad de Alzheimer.

La esclerosis múltiple es una enfermedad heterogénea en su presentación y evolución en la que el 80-85% de los pacientes presentan un curso clínico que evoluciona a brotes autolimitados que a medida que se repiten van ocasionando un déficit residual funcional (forma remitente-recurrente; EM-RR). Tras 10-15 años de evolución el 50% de ellos pasarán a tener un curso secundariamente progresivo de incremento de la discapacidad no relacionado con los brotes (forma secundariamente progresiva; EM-SP), y tras 25 años el porcentaje alcanza al 90% de los pacientes. En un 10% de los casos el curso es progresivo desde el inicio (forma primariamente progresiva; EM-PP). Un 10 a 20% de los pacientes se mantendrán sin secuelas importantes 15 años después del inicio de la enfermedad (formas benignas) y en un 1-3% de los casos, sin embargo, los pacientes evolucionarán acumulando una gran discapacidad en pocos meses tras el debut de la enfermedad (formas agresivas o fulminantes).

El interferón beta (Betaferon®, RebifV, Avonex®) y el acetato de glatiramero o copolimero (Copaxone®) son los primeros medicamentos que han mostrado efectos beneficiosos en la forma remitente recurrente de la esclerosis múltiple. Estos medicamentos disminuyen la formación de placas y el número de brotes en un tercio comparado con pacientes sin tratamiento. Recientemente se ha incluido el tratamiento con Natalizumab (Tysabri®) a la terapia de la esclerosis múltiple, teniendo una eficacia mayor que los previos (previenen de brotes aproximadamente 60%), aunque con potenciales efectos secundarios graves. Sin embargo, la respuesta individual al tratamiento es impredecible y varia desde la excelencia a una total ineficacia. La falta de test biológicos que predigan la actividad y agresividad de la enfermedad impiden prescribir el mejor tratamiento a cada paciente y obliga a realizar un tratamiento preventivo y de por vida con el consiguiente coste en calidad de vida y económico. El poder contar con un test predictivo de agresividad y actividad de la enfermedad permitiría realizar un tratamiento personalizado.

Métodos estándar de diagnóstico de la esclerosis múltiple incluyen determinación de los niveles de IgG en LCR, imagen del cerebro mediante resonancia magnética y de la médula espinal y exclusión de otras enfermedades autoinmunes mediante determinaciones en suero. Aunque recientemente se ha estudiado la utilidad de dichos test en predecir el curso de la esclerosis múltiple, su capacidad predictiva es muy limitada y en la práctica clínica se emplean con fines diagnósticos pero no pronósticos ni para decidir o monitorizar la terapia. Por tanto, sigue siendo problemático el llegar a un diagnóstico y a un pronóstico adecuado.

Los diferentes estudios de historia natural de la esclerosis múltiple han permitido identificar algunas variables clínicas asociadas con la evolución de la esclerosis múltiple. Los factores que mejor predicen un curso relativamente benigno son pertenecer al género femenino, inicio de la enfermedad a temprana edad (menos de 30 años), ataques poco frecuentes, un patrón remitente-recurrente y levedad de la enfermedad en los estudios mediante resonancia magnética del sistema nervioso central. Por el contrario, los factores que predicen un curso mas agresivo son el sexo varón e inicio tardío (por estar asociado con las formas progresivas), la recidiva del segundo brote en el primer año tras el primer brote, acumular discapacidad de forma precoz, el inicio clínico con síntomas motores o de coordinación y la persistencia de secuela tras el primer brote, y especialmente el alcanzar ciertos niveles de discapacidad (escala Kurtzke Expanded Disability Status EDSS: 3.0, 4.0, 6.0) en edades tempranas.

Hasta la fecha se han intentado desarrollar métodos de diagnóstico y de pronóstico basados en la detección de autoanticuerpos en suero (Bielekova,B. y, Martin R. Brain. 2004 Jul;127(Pt 7):1463-78.; Berger, T. y Reindl, M., 2006, Disease Markers, 22:207-212). Por ejemplo, Berger, T. et al. (New England J. Medicine, 2003, 146:181-197) han descrito que la presencia de anticuerpos anti-mielina (anti-MOG) son capaces de predecir el riesgo de primera recaída en pacientes que sufre síndrome clínicamente aislado, sugestivo de esclerosis múltiple. Sin embargo estudios bien diseñados posteriores no han podido confirmar su utilidad predictora (Kuhie J. et al., N Engl J Med. 2007, 356:371-8.; Pelayo R. et al. N. Engl. J. Med. 2007, 356:426-8).

Sin embargo, hasta la fecha no se ha identificado ningún anticuerpo que cumpla los requisitos de biomarcador diagnóstico o pronóstico de esclerosis múltiple, como tampoco la determinación simultanea de varios autoanticuerpos es de utilidad, así como las dificultades y alto coste que supone.

Por otro lado, los estudios de expresión génica (transcriptoma) mediante chips de ADN permiten tener una visión global de los genes que están participando en un proceso, por lo que este tipo de análisis podría convertirse en una valiosa herramienta clínica para el diagnóstico o el pronóstico de MS.

Hasta la fecha se han descrito diferencias en los niveles de expresión de diversos genes en la esclerosis múltiple, que podrían llegar a ser candidatos a biomarcadores de esclerosis múltiple (revisados en Goertsches, R. et al., 2006, Current Pharmaceutical Design, 12:3761-3779). En estos estudios se compararon los patrones de expresión entre pacientes con esclerosis múltiple y controles, pero no se llegó a estudiar de forma especifica la asociación entre dichos patrones y el curso evolutivo y pronóstico de la enfermedad.

Ramanathan et al (J. Neuroimmunol., 2001, 116:213-219) han descrito 34 genes diferencialmente expresados en pacientes de EM-RR en comparación con sujetos sanos, la mayoría de ellos relacionados con procesos inflamatorias e inmunes.

Bomprezzi et al. (Human Molecular Genetics, 2003, 12:2191-2199) identificaron una serie de genes cuyos niveles de expresión en PBMCs permite distinguir pacientes de EM-RR y de EM-SP y de voluntarios sanos. Mediante este abordaje, se pudieron identificar más de mil genes que permitían distinguir muestras de esclerosis múltiple de controles. Los genes fuertemente dominantes incluyeron HSP70 y la CDC28 proteina kinasa CDC28 (CKS) 2, que combinados con la histona H I de la familia (HIF) 2 y el PAFAH1B1, respectivamente, permitían una buena discriminación entre esclerosis múltiple y controles. Estos pares tenían valor de predicción del 80% para clasificar una muestra independiente en la clase correcta. También se observó una correlación entre los pares más discriminatorios de genes y vías biológicas relevantes de la esclerosis múltiple. Tales moléculas, que se encontraban altamente expresadas en esclerosis múltiple incluían CD27, el receptor de TNF, el locus alfa del receptor de células T y su cadena asociada ZAP70, y la proteína del dedo de zinc (ZNF) 148. Además, el receptor IL-7 (IL-7R), que se requiere para el desarrollo de células T y B, estaba también fuertemente sobre-expresado. Los genes reprimidos en esclerosis múltiple fueron HSP70 y CKS2, ambos implicados en la regulación de la apoptosis. Se ha sugerido previamente que HSP70 puede ser un autoantígeno en esclerosis múltiple, pero puede también estar implicado en la degradación del mRNA en la via ubiquitin-proteasoma. La activación de los procesos de remodelamiento de la matriz extracelular era evidente por la sobre expresión de...

1. Un método in vitro para determinar el pronóstico clínico de un paciente afecto de esclerosis múltiple que comprende

        (a) comparar

(i) el valor correspondiente a la expresión de los genes KLHDC5, CASP2, EMID1, PRO1073, BTBD7, MGC2518, WDR20bis, NEK4, SYLT2, DOCK10, TTC10, PTPRC y CTLA4 con una tabla de probabilidades condicionadas entre intervalos de valores modales de expresión de dichos genes y valores de probabilidad de que la esclerosis múltiple sea de buen o de mal pronóstico y/o

(ii) el valor de una variable clínica seleccionada del grupo de EDSS y MSFC con una tabla de probabilidades condicionadas entre intervalos de valores modales de dichas variables clínicas y valores de probabilidad de que la esclerosis múltiple sea de buen o de mal pronóstico y

        (b) asignar una probabilidad de mal y buen pronóstico correspondiente a la probabilidad asociada al intervalo en el que se encuentra el valor de la expresión o de la variable clínica.

2. Un método in vitro para determinar el pronóstico clínico de un paciente afecto de esclerosis que comprende

        (a) comparar

(i) los valores correspondientes a la expresión de los genes seleccionados del grupo de KLHDC5, CASP2, EMID1, PRO1073, BTBD7, MGC2518, WDR20bis, NEK4, SYLT2. DOCK10, TTC10, PTPRC y CTLA4 con una tabla de probabilidades condicionadas entre intervalos de valores modales de expresión de dichos genes y valores de probabilidad de que la esclerosis múltiple sea de buen o de mal pronóstico y/o

(ii) los valores de las variables clínicas EDSS y MSFC con una tabla de probabilidades condicionadas entre intervalos de valores modales de dichas variables clínicas y valores de probabilidad de que la esclerosis múltiple sea de buen o de mal pronóstico y

        (b) asignar una probabilidad de mal pronóstico correspondiente a la probabilidad condicionada de mal pronóstico asociada a los intervalos de valores modales en los que se encuentran los valores de expresión de cada uno de los genes cuya expresión se ha determinado y/o variables clínicas determinadas y asignar una probabilidad de buen pronóstico correspondiente a la probabilidad condicionada de buen pronóstico asociada a los intervalos de valores modales en los que se encuentra los valores de expresión para cada uno de los genes cuya expresión se ha determinado y/o variables clínicas determinadas.

3. Método según la reivindicación 1 o 2 en donde la determinación de los valores de expresión de los distintos genes se determina mediante PCR en tiempo real.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en donde la tabla de probabilidades condicionadas entre los niveles de expresión de cada uno de los genes y los valores de probabilidad de que la esclerosis múltiple sea de buen o de mal pronóstico y entre los valores modales de cada una de las variables clínicas y los valores de probabilidad de que la esclerosis múltiple sea de buen o de mal pronóstico son las indicada en la tabla 14.

5. Un kit que comprende un conjunto de sondas en donde dicho conjunto comprende una sonda específica para cada uno de los genes indicados en al menos una tabla seleccionada del grupo de tablas 3, 5-8 y 11, en donde las sondas específicas para los genes del grupo de tablas 3, 5-8 y 11 son las sondas mencionadas en dichas tablas.

6. Un kit según la reivindicación 5, en donde el conjunto de sondas consiste en una sonda específica para cada uno de los genes indicados en al menos una tabla seleccionada del grupo de tablas 3, 5-8 y 11.

7. Un kit según la reivindicación 6 en donde el conjunto de sondas consiste en una sonda específica para cada uno de los genes que se indica en la tabla 11.

8. Un kit según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 en donde el kit comprende, adicionalmente, al menos una sonda específica para un gen de referencia de expresión constitutiva.

9. Un kit según la reivindicación 8 en donde el al menos un gen de referencia se selecciona del grupo de GABPA, UBC, beta-actin y beta-microglobulina.

10. Un kit según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9 en donde las sondas se encuentran formando parte de una matriz.

11. Un kit según la reivindicación 10 en donde la matriz es una LDA (low-density array).

12. Uso de un kit según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11 para la determinación del pronóstico de un enfermo diagnosticado de esclerosis múltiple, para determinar la eficacia de un tratamiento para la esclerosis múltiple o para diagnosticar la esclerosis múltiple en un paciente.