Un método para identificar genes pesticidas, comprendiendo el método:

a) diseñar al menos un par de cebadores oligonucleotídicos para el uso en una primera ronda de PCR que sea específico para un grupo diana de genes pesticidas, comprendiendo el par de cebadores un cebador directo y un cebador inverso, donde cada cebador se dirige a una secuencia distintiva presente en las secuencias de nucleótidos del grupo diana;

b) obtener una primera muestra de material de ácido nucleico de un microorganismo de interés;

c) mezclar la primera muestra de material de ácido nucleico con el al menos un par de cebadores oligonucleotídicos para el uso en la primera ronda de PCR y una ADN polimerasa termoestable en condiciones que son adecuadas para la amplificación por PCR;

d) realizar una primera ronda de PCR y detectar los productos de amplificación por PCR, determinando de este modo si se producen productos de PCR en la primera ronda de PCR;

e) obtener una segunda muestra de material de ácido nucleico del microorganismo si se detectan productos de PCR en la primera ronda de PCR;

f) diseñar al menos un par de cebadores oligonucleotídicos para el uso en una segunda ronda de PCR que sea específico para el grupo diana de genes pesticidas, comprendiendo el par de cebadores un cebador directo y un cebador inverso, donde cada cebador se dirige a una secuencia distintiva presente en las secuencias de nucleótidos del grupo diana;

g) mezclar la segunda muestra de material de ácido nucleico con el al menos un par de cebadores oligonucleotídicos para el uso en la segunda ronda de PCR y una ADN polimerasa termoestable en condiciones que son adecuadas para la amplificación por PCR y realizar una segunda ronda de PCR;

h) separar cualquier producto de amplificación por PCR producido en la segunda ronda de PCR usando electroforesis en gel de agarosa y aislar los fragmentos de ácido nucleico para el análisis posterior, donde los fragmentos de ácido nucleico pueden comprender un supuesto fragmento génico pesticida novedoso;

i) clonar cada fragmento de ácido nucleico en un vector de clonación;

j) transformar las células hospedadoras con los vectores de clonación, donde los vectores de clonación comprenden los fragmentos de ácido nucleico aislados en la etapa (h);

k) preparar muestras de ácido nucleico de colonias hospedadoras individuales que comprenden un vector de clonación;

l) someter las muestras de ácido nucleico de las colonias hospedadoras individuales a análisis de transferencia puntual usando sondas marcadas que son específicas para todos los genes pesticidas conocidos del grupo diana, donde un fragmento de ácido nucleico aislado en la etapa (h) que no se detecta durante la etapa de análisis de transferencia puntual comprende un supuesto fragmento génico pesticida novedoso; y

m) analizar el supuesto fragmento génico pesticida novedoso

Método para identificar genes novedosos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos y composiciones para identificar genes novedosos que son homólogos a genes conocidos, particularmente genes Cry de Bacillus thuringiensis (Bt).

Antecedentes de la invención

Las plagas de insectos son un factor muy importante en la pérdida de los cultivos agrícolas mundiales. Por ejemplo, el daño por la alimentación del gusano del maíz y el daño por el picudo del algodonero pueden ser económicamente devastadores para los productores agrícolas. La pérdida de cultivos relacionada con plagas de insectos solamente por el gusano del maíz ha alcanzado mil millones de dólares anuales.

Tradicionalmente, los métodos principales para afectar a las poblaciones de plagas de insectos, tales como poblaciones de gusano del maíz, son rotación de cultivos y la aplicación de pesticidas químicos sintéticos de amplio espectro. Sin embargo, los consumidores y reguladores gubernamentales por igual están siendo cada vez más conscientes de los riesgos ambientales asociados con la producción y el uso de pesticidas químicos sintéticos. Debido a tales preocupaciones, los reguladores han bloqueado o limitado el uso de algunos de los pesticidas más peligrosos. Por tanto, existe un interés sustancial en desarrollar alternativas a pesticidas químicos tradicionales que presenten un menor riesgo de polución y riesgos ambientales y proporcionen una mayor especificidad diana de lo que es característico de los insecticidas químicos de amplio espectro tradicionales.

Se conoce que ciertas especies de microorganismos del género Bacillus poseen actividad pesticida contra una gran variedad de plagas de insectos que incluyen Lepidoptera, Diptera, Coleoptera, Hemiptera y otros. Bacillus thuringiensis (Bt) y Bacillus papilliae están entre los agentes de biocontrol más exitosos descubiertos hasta la fecha. La patogenia de insectos se ha atribuido a las cepas de: B. larvae, B. lentimorbus, B. papilliae, B. sphaericus, Bt (Harwook, ed. (1989) Bacillus (Plenum Press), pág. 306) y B. cereus (Publicación Internacional Nº WO 96/10083). La actividad pesticida parece estar concentrada en inclusiones proteicas cristalinas parasporales, aunque también se han aislado proteínas pesticidas del estadio de crecimiento vegetativo de Bacillus. Se han aislado y caracterizado varios genes que codifican estas proteínas pesticidas (véase, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 5.366.892 y 5.840.868).

Los pesticidas microbianos, particularmente los obtenidos de cepas de Bacillus, han desempeñado un papel importante en la agricultura como alternativas al control químico de plagas. Las proteínas pesticidas aisladas de cepas de Bt, conocidas como d-endotoxinas o toxinas Cry, se producen inicialmente en una forma de protoxina inactiva. Estas protoxinas se convierten proteolíticamente en una toxina activa mediante la acción de proteasas en el intestino del insecto. Véase, Rukmini et al. (2000) Biochimie 82: 109-116; Oppert (1999) Arch. Insect Biochem. Phys. 42: 1-12; y Carroll et al. (1997) J. Invertebrate Pathology 70: 41-49. La activación proteolítica de la toxina puede incluir la eliminación de péptidos N- y C-terminales de la proteína así como escisión interna de la proteína. Una vez activada, la toxina Cry se une con alta afinidad a receptores sobre células epiteliales en el intestino del insecto, creando de este modo canales permeables en la membrana celular, lisis del intestino del insecto y muerte posterior del insecto por inanición y septicemia. Véase, por ejemplo, Li et al. (1991) Nature. 353: 815-821.

Recientemente, científicos agrícolas han desarrollado plantas de cultivo con resistencia a insecto mejorada modificando genéticamente plantas de cultivo con genes pesticidas para producir proteínas pesticidas de Bacillus. Por ejemplo, las plantas de maíz y algodón modificadas genéticamente para producir toxinas Cry (véase, por ejemplo, Aronson (2002) Cell Mol. Life Sci. 59(3): 417-425; Schnepf et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62(3): 775-806) ahora se usan ampliamente en la agricultura americana y han proporcionado al agricultor una alternativa respetuosa con el medio ambiente a métodos tradicionales de control de insectos. Además, se han desarrollado patatas modificadas genéticamente para contener toxinas Cry pesticidas. Estos éxitos con la ingeniería genética han llevado a los investigadores a buscar genes pesticidas novedosos, particularmente genes Cry. Por lo tanto, en la técnica se necesitan nuevos métodos para identificar de forma eficaz genes pesticidas novedosos, incluyendo los que son homólogos a genes Cry conocidos, así como los que representan familias novedosas de genes Cry.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a métodos y composiciones para identificar genes novedosos. Los métodos descritos en este documento permiten la exploración rápida y eficaz de un gran número de secuencias de nucleótidos para identificar genes novedosos potenciales de una diversidad de organismos. Los presentes métodos para identificar genes novedosos permiten la identificación de genes que son homólogos a genes conocidos así como genes completamente novedosos que pueden ser miembros de familias actualmente no identificadas de genes de interés, incluyendo genes pesticidas. En ciertos aspectos de la invención, los métodos permiten la identificación de genes pesticidas novedosos que son homólogos a genes pesticidas conocidos, incluyendo, por ejemplo, genes de toxina Cry de Bt.

Los métodos de la invención comprenden diseñar sistemáticamente cebadores oligonucleotídicos que son específicos para regiones de homología (es decir, secuencias distintivas) dentro de un grupo diana de genes conocidos de interés (por ejemplo, genes pesticidas) y realizar una primera ronda de amplificación por PCR de material de ácido nucleico de un organismo de interés. La primera ronda de PCR tiene por objeto amplificar genes tanto conocidos como novedosos que contengan la secuencia distintiva. Si se detectan productos de PCR en la primera ronda de PCR, se obtiene una segunda muestra de material de ácido nucleico del organismo y se somete a una segunda ronda de PCR usando un segundo conjunto de cebadores oligonucleotídicos que son específicos para secuencias distintivas en el grupo diana de genes. Los productos de PCR de la segunda ronda de PCR se separan por electroforesis en gel de agarosa y los ácidos nucleicos aislados resultantes se clonan en vectores de clonación, particularmente vectores de clonación bacterianos. Después, los vectores de clonación se introducen por transformación en células hospedadoras competentes tales como células bacterianas. El material de ácido nucleico aislado de colonias de células hospedadoras individuales se analiza por análisis de hibridación de transferencia puntual usando sondas oligonucleotídicas marcadas que son específicas para todos los genes conocidos en el grupo diana. La etapa de análisis por transferencia puntual del método de la invención tiene por objeto identificar y eliminar genes conocidos del grupo diana de una consideración adicional. Los productos de PCR amplificados en la segunda ronda de PCR que no se detectan por análisis de transferencia puntual comprenden supuestos genes novedosos (por ejemplo, genes pesticidas novedosos) o fragmentos de los mismos. Estos ácidos nucleicos se someten a análisis de secuencia adicional para confirmar la novedad y para determinar secuencias de nucleótidos. Los supuestos genes novedosos se expresan y las proteínas recombinantes se ensayan para evaluar la actividad biológica, tal como actividad pesticida, cuando se usan los métodos de la invención para identificar genes pesticidas novedosos. Los métodos de la invención son susceptibles de forma adicional a automatización y exploración de alto rendimiento.

Las composiciones de la invención incluyen polinucleótidos aislados novedosos y variantes y fragmentos de los mismos, que comprenden genes novedosos, que incluyen, por ejemplo, genes pesticidas novedosos. También se proporcionan polipéptidos codificados por los polinucleótidos de la invención. Los genes pesticidas novedosos (por ejemplo, genes de toxina Cry de Bt) identificados por los métodos descritos en este documento se usan en la protección de plantas contra plagas, particularmente plagas de insectos y daños relacionados con plagas.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 proporciona una representación esquemática del diseño...

1. Un método para identificar genes pesticidas, comprendiendo el método:

2. El método de la reivindicación 1, en el que el microorganismo de interés comprende una cepa de Bacillus thuringiensis.

3. El método de la reivindicación 1, en el que el grupo diana de genes pesticidas comprende genes Cry de Bacillus thuringiensis.

4. El método de la reivindicación 3, en el que el grupo diana comprende genes Cry de Bacillus thuringiensis que tienen actividad pesticida contra insectos del orden Coleoptera.

5. El método de la reivindicación 1, en el que la primera ronda de PCR comprende realizar PCR en tiempo real cuantitativa.

6. El método de la reivindicación 5, en el que la primera ronda de PCR se realiza en presencia de una entidad fluorescente, siendo capaz la entidad fluorescente de indicar la presencia de productos de PCR y proporcionar una señal relacionada con la cantidad de productos de PCR.

7. El método de la reivindicación 1, en el que las sondas marcadas que son específicas para todos los genes pesticidas conocidos del grupo diana usadas para el análisis de transferencia puntual se diseñan para ser específicas para una región presente en los fragmentos de ácido nucleico generados durante la segunda ronda de PCR.

8. El método de la reivindicación 1, en el que

9. El método de la reivindicación 3, en el que

10. El método de la reivindicación 1, en el que el análisis del supuesto fragmento génico pesticida novedoso comprende análisis de secuencia de nucleótidos, comprendiendo dicho análisis de secuencia de nucleótidos secuenciar el ácido nucleico que comprende un supuesto fragmento génico pesticida novedoso y comparar la secuencia de nucleótidos del supuesto fragmento génico pesticida novedoso con todos los genes pesticidas conocidos, determinando de este modo si el fragmento es novedoso.

11. El método de la reivindicación 10, que comprende además secuenciar el supuesto gen pesticida novedoso de longitud completa si se determina que el fragmento es novedoso y que comprende opcionalmente además clonar el gen pesticida novedoso en un vector de clonación y evaluar la actividad pesticida del polipéptido codificado por el gen pesticida novedoso.

12. El método de la reivindicación 1, en el que el al menos un par de cebadores oligonucleotídicos específico para un grupo diana de genes pesticidas usado en la primera ronda de PCR comprende cebadores que son específicos para regiones de homología compartidas por todos los miembros del grupo diana.

13. El método de la reivindicación 12, en el que los cebadores oligonucleotídicos inversos de la primera ronda de PCR se usan para generar los cebadores directos para la segunda ronda de PCR.

14. El método de la reivindicación 1, en el que los cebadores oligonucleotídicos directo e inverso usados en la primera ronda de PCR son complementarios a secuencias de nucleótidos dentro del grupo diana de genes pesticidas que están separados entre 50 pares de bases (pb) y 150 pb.

15. El método de la reivindicación 1, en el que los cebadores oligonucleotídicos usados en la segunda ronda de PCR se diseñan para generar fragmentos de 600 pb a 750 pb de longitud.

16. El método de la reivindicación 1, en el que

17. El método de la reivindicación 16, en el que:

18. El método de la reivindicación 17, parte (A), en el que la mezcla de pares de cebadores oligonucleotídicos diseñados de acuerdo con la reivindicación 17, parte (A), se usa en la primera ronda de PCR; o de la reivindicación 17, parte (B), en el que la mezcla de pares de cebadores oligonucleotídicos diseñados de acuerdo con la reivindicación 17, parte (B), se usa en la segunda ronda de PCR.

19. El método de 8(b) o 16(B), en el que la T_m es de 52ºC a 56ºC.

20. El método de la reivindicación 1, en el que una mezcla de pares de cebadores oligonucleotídicos degenerados diseñados de acuerdo con la reivindicación 17, parte (A), se usa en la primera ronda de PCR y en el que una mezcla de pares de cebadores oligonucleotídicos degenerados diseñados de acuerdo con la reivindicación 17, parte (B), se usa en la segunda ronda de PCR.

21. Un método para identificar genes novedosos que comparten homología con un grupo diana de genes conocidos, comprendiendo el método: