Un conjugado ligando-inhibidor con una estructura **Fórmula** en la que n = 1-2 y x es -NH-CO-(CH2)3-fenitoína

5 Antecedentes de la invención

Esta invención está relacionada en general con el campo de la medición de un analito en un medio líquido. Más en especial, está relacionada con un inmunoensayo para la medición de un analito en una muestra biológica. Boguslaski, R.C. et al., en la Patente Estadounidense Nº 4,134,792 (1979) describe el uso de un modulador enzimático de unión reversible como sustancia de marcaje para la detección de un analito en un medio líquido, y en particular, el uso de inhibidores competitivos acoplados a un análogo del analito en inmunoensayos.

Dorn, A.R., en la Patente Estadounidense con Nº de serie 09/328,741 depositada el 9 de junio de 1999 (US 6,107,052 A) describe un método para la medición enzimática de ácido micofenólico en una muestra biológica, e inmunoensayos que comprenden conjugados de MPA (WO 01/01135 A, Clin. Chem. 47 (2001), 1921-1922).

La inosina-5'-monofosfato deshidrogenasa (EC 1,1,1,205) cataliza la oxidación dependiente de NAD de la inopina-5'monofosfato (IMP) en xantosina-5'-monofosfato (XMP), Magasanik, B. et al., J. Biol. Chem. 226:339-350 15 (1957) y Jackson et al., Nature 256:331-333 (1975). La enzima sigue una secuencia de reacción Bi-Bi ordenada de unión de sustrato y cofactor y liberación del producto. Primero, la IMP se une a IMPDH. A continuación viene la unión del cofactor NAD. El cofactor reducido, NADH, se libera entonces del producto, seguido del producto, XMP. Este mecanismo difiere del de la mayoría de deshidrogenasas dependientes de NAD conocidas, que poseen un orden aleatorio de adición de sustrato o requieren la unión de NAD previa a la del sustrato.

25 Dos isoformas de IMPDH humano, denominadas tipo I y tipo II, se han identificado y secuenciado, Collart et al., J. Biol. Chem. 263:15769-15772 (1988) y Natsumeda et al., J. Biol. Chem. 265:5292-5295 (1990). Cada isoforma es de 514 aminoácidos, y ambas isoformas presentan una identidad de secuencia del 84%. Ambas IMPDH de tipo I y tipo II forman tetrámeros activos en solución, con pesos moleculares de las subunidades de 56 kDa, Yamada et al., Biochemistry 27:2737-2745 (1988). 25

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a un conjugado ligando-inhibidor con una estructura 35

**(Ver fórmula)**

En la que n = 1-2 y

40 x es -N11 -CO-(CN2)3-fenitoína,

Se describe un inmunoensayo cuantitativo homogéneo específico para ácido micofenólico basado tras la inhibición específica no competitiva de la enzima inosina-5'-monofosfato deshidrogenasa (IMPDH) mediante ácido micofenólico. La inhibición de IMPDH depende solo de la concentración de ácido micofenólico debido a la naturaleza

45 no competitiva de la inhibición por ácido micofenólico. Así, cuanto mayor es la concentración de ácido micofenólico, mayor es la inhibición de la enzima. La reacción se monitoriza midiendo la formación de nicotinamida adenina dinucleótido reducida (NADH) a 340 nm. La IMPDH cataliza la siguiente reacción:

 inosina-IMPDH xantosina monofosfato + NADH monofosfato + NAD+

50 El desarrollo de un inmunoensayo homogéneo puede lograrse a través de la unión de un ligando a una posición sobre el ácido micofenólico o un derivado de MPA o cualquier inhibidor no competitivo de IMPDH en el que dicha unión no interfiere con la inhibición no competitiva de IMPDH. En ausencia del analito, el anticuerpo específico de analito se une al ligando-derivado de MPA y previene su inhibición de IMPDH. En presencia de analito, el analito se

55 une a su anticuerpo, liberando así el ligando-derivado de MPA para inhibir la IMPDH (Tabla 3, parte C.).

La tasa de formación de NADH (nicotinamida adenina dinucleótido reducida) puede medirse mediante la monitorización del cambio de absorción a una longitud de onda de 340 nm, es decir, la región de absorción característica de NADH, y este cambio en la absorción puede correlacionarse con la concentración de analito.

**(Ver fórmula)**

Las posiciones atractivas para la unión de ligando ocurren en la cadena hexanoica del ácido micofenólico y sus derivados, especialmente en el carbono 4' y el carbono 5' (Figura 1). Varios compuestos reúnen estos criterios. Véase Nelson, P.H. et al., Journal of Medicinal Chemistry 33:833-838 (1990), Rohloff, J.C.,et al., Tetrahedron Letters 36 (43):7803-7806 (1995), Artis, D.R. et al., Publicación PCT WO 95/22536 (1995) y Artis, D.R. et al., Publicación PCT WO 95/22538 (1995). Varios de estos derivados muestran una mayor inhibición que el ácido micofenólico y esto puede impartir una mayor sensibilidad para un inmunoensayo homogéneo. Véase Smith, D.B. et al., J. Org. Chem. 61:2236-2241 (1996).

En una realización preferible de la presente invención, un inhibidor no competitivo, ácido micofenólico (MPA) se acopló a fenitoína como ligando y se utilizó en un inmunoensayo homogéneo para el ácido micofenólico.

El uso de un conjugado inhibidor no competitivo-ligando es preferible sobre un conjugado inhibidor competitivo-ligando ya que el anterior conjugado es bastante menos susceptible a las interferencias de fármacos y sustancias naturales, que normalmente pueden ser inhibidores competitivos de enzimas. Los inhibiditos no competitivos de enzimas son raros en la naturaleza y serán por lo tanto menos susceptibles a las interferencias con fármacos y sustancias naturales.

El inmunoensayo homogéneo descrito anteriormente puede utilizarse para medir cualquier analito. Aquí se ejemplifica específicamente su uso para la medición de ácido micofenólico, digoxigenina, tiroxina y teofilina. También se piensa que el uso para la medición de cualquier analito incluyendo fármacos o derivados de fármacos, hormonas, polipéptidos y oligonucleótidos. Ejemplos de otros fármacos o derivados de fármacos que pueden ser adecuados para el ensayo utilizando el método, incluye fármacos terapéuticos como antibióticos, por ejemplo, gentamicina, amicacina, tobramicina, netilmicina y vancomicina; fármacos cardíacos, por ejemplo, digoxina, digitoxina, N-acetilprocainamida, procainamida, quinidina y lidocaína; fármacos anticonvulsivos, por ejemplo, fenitoína, (de acuerdo con la presente invención) fenobarbital, primidona, ácido valproico, etosuximida y carbamazepina; analgésicos, por ejemplo, acetaminofen y ácido acetilsalicílico; e inmunosupresores, por ejemplo, MPA, ciclosporina, rapamicina (sirolimus) y FK506 (tacrolimus), y fármacos de abuso como anfetaminas, barbitúricos, benzodiazepinas, cannabinoides, metabolito de cocaína (benzoilecgonina), metadona, opiáceos, fenciclidina, propoxifeno y LSD. Ejemplos de hormones que pueden ser adecuadas para el ensayo utilizando el método descrito incluye tiroxina, hormona estimuladora de la tiroides, estrógeno, progesterona, testosterona, prolactina, hormona estimuladora de los folículos, gonadotropina coriónica y hormona luteinizante. Ejemplos de polipéptidos que pueden ser adecuados para el ensayo utilizando el método incluye proteínas y epítopos como hemoglobina A1c, troponina-T y troponina-I. Ejemplos de oligonucleótidos que pueden ser adecuados para el ensayo utilizando el método descrito incluye secuencias específicas de oligonucleótido que pueden hibridar bajo condiciones astringentes con secuencias suficientemente específicas para la detección y cuantificación de la gonorrea, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), clamidia e infecciones de hepatitis.

También se describe un equipo de pruebas para llevar a cabo un ensayo para la determinación de analito mediante el método de la presente invención que comprende, en combinaciones empaquetadas, una o más composiciones de reactivos que comprende NAD, IMPDH, IMP y un conjugado que comprende MPA y un ligando del analito.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 ilustra la estructura de ácido micofenólico y la estructura del conjugado ligando-inhibidor, MPA-MPA (bis-MPA).

La Figura 2 es una gráfica preparada mediante la representación de los resultados obtenidos en el Ejemplo 20 en el que se analizaron las muestras que contienen tiroxina. La concentración de tiroxina está representada en el eje X y la absorbancia delta (criterio de valoración) a 340 nm está representada en el eje Y.

La Figura 3 es una gráfica preparada mediante la representación de los resultados obtenidos en el Ejemplo 23 en el que se analizaron las muestras que contienen digoxigenina. La concentración... [Seguir leyendo]

1. Un conjugado ligando-inhibidor con una estructura

**(Ver fórmula)**

en la que n = 1-2 y x es -NH-CO-(CH2)3-fenitoína.