Glucoproteína de tipo mucina que presenta una estructura repetida que comprende 3 a 2000 unidades que se repiten,

teniendo cada una, una secuencia de aminoácidos representada por la fórmula I: [en la que Xaa representa Val o Ile], Val-Xaa-Glu-Thr-Thr-Ala-Ala-Pro (I) en la que uno o más restos de aminoácidos en la estructura están unidos a una cadena de azúcar que consiste en uno o más monosacáridos

Campo técnico

La presente invención se refiere a una nueva glucoproteína de tipo mucina, y a un método para producir la misma. La presente invención también se refiere a una composición que comprende la nueva glucoproteína de tipo mucina. Además, la presente invención se refiere a un marcador de peso molecular que comprende la nueva glucoproteína de tipo mucina.

Antecedentes de la invención

Entre las glucoproteínas, los compuestos de glucoproteínas de pesos moleculares elevados, en los que una cadena de azúcar que comprende aproximadamente uno a diez monosacáridos está unida, vía un enlace O-glucosídico, a intervalos regulares, a una cadena peptídica que tiene una estructura repetida simple, se denominan colectivamente mucinas. Diversas mucinas están presentes en las células o como componentes en el moco de plantas y animales en el mundo natural, y se sabe que desempeñan diversos papeles importantes en los sistemas vivos. Además, se sabe que las mucinas procedentes de plantas y animales, y contenidas en componentes del moco en alimentos, dan efectos biológicos importantes en la actividad de la vida o en procesos de digestión y absorción, incluso cuando se ingieren como alimentos.

Hasta la fecha, se han identificado en seres humanos aproximadamente diez tipos de mucinas. Estas mucinas están distribuidas y presentes principalmente en porciones mucosales tales como la saliva y la mucosa gástrica. Los tejidos mucosales formados por estas mucinas presentas papeles biológicos tales como efectos antibacterianos como una matriz extracelular, mediante los cuales se bloquean las infecciones víricas o similares, además de efectos físicos tales como la retención de humedad, protección, y lubricación de células y tejidos (H. Nakata, Diversity of Mucin and Mucin-type Sugar Chain and Its Meaning: Understandable Glycobiology in Post-Genomic Era, Wakaru Jikken-Igaku Series (Understandable Experimental Medicine) (en Japonés), N. Taniguchi ed., Capítulo 3, Yodosha Co., Ltd., 2002; K. Hotta, K. Ishihara, Search for Attractiveness of Gastric Mucus: Elucidation of Mucin using Newest Approach (en Japonés), Medical View Co., Ltd., 1999).

Los efectos fisiológicos de estas mucinas no siempre resultan de reacciones químicas específicas. También se considera que sus efectos biológicos derivan de sus propiedades físicas como sustancia, es decir, morfología, incluyendo plasticidad, viscosidad, propiedades humectantes, etc., y de su capacidad para reconocer una amplia variedad de moléculas (por ejemplo, lecitina) debido a la porción de cadena de azúcar amorfa unida a la cadena peptídica que tiene una estructura tridimensional. De este modo, las propiedades físicas y la estructura tridimensional de la porción polimérica comprendida por la cadena peptídica de mucinas, así como la capacidad de reconocimiento molecular por la porción de cadena de azúcar amorfa, son necesarias para ejercer sus funciones.

Por otro lado, tales compuestos que constituyen componentes parciales o principales de la mucosa o una matriz extracelular ejercen sus efectos incluso cuando se ingieren desde el exterior. Por lo tanto, actualmente se ha considerado que estos compuestos tienen una gran ventaja por cuanto se pueden producir artificialmente y suministrar al mercado como fármacos, cosméticos, alimentos, etc. (documento JP 8-269091A (1996)). Entre los compuestos de la cadena de azúcar, por encima de todos los demás, se han extraído y purificado de diversas materas primas la condroitina, el sulfato de condroitina, y el ácido hialurónico, etc., componentes principales de una matriz extracelular, y se han proporcionado al mercado como alimentos, fármacos, cosméticos, etc. Sin embargo, las mucinas se toman meramente de la dieta procedente, por ejemplo, de algunos alimentos (aroide, ocra, oreja de Judas) o animales (ganado vacuno y cerdos) (véanse los documentos JP 7-33623A (1995); JP 8-256788A (1996); JP 6-199900A (1994); JP 5-310799A (1993); y JP 7-126292A (1995)), y todavía no se han suministrado como compuestos a gran escala y en grandes cantidades.

Las glucoproteínas que incluyen mucinas tienen la capacidad de reconocimiento molecular, y se espera que sean útiles en diversos usos, tales como en fármacos. No obstante, no se ha encontrado un método apropiado para sintetizarlas. En algunos casos, se han identificado los genes que codifican las secuencias peptídicas. Sin embargo, los enfoques tales como la transferencia o clonación génica han logrado poco éxito debido a la dificultad para introducir cadenas de azúcar tras la síntesis de la cadena peptídica (Polysaccharide Separation/Purification Method, Biological and Chemical Experimental Methods 20 (en Japonés), editado por K. Matsuda, Japanese Scientific Societies Press, 1987). Para la mayoría de las glucoproteínas, sus métodos sintéticos tienen sin excepción un enfoque que implica sintetizar sólo la cadena peptídica mediante uso de E. coli o similar e introducir secuencialmente en ella cadenas de azúcar (véase el documento WO 96/13516). Tal enfoque tiene la desventaja de que es inadecuado para la producción a gran escala.

Las glucoproteínas incluyen aquellas con cadenas de azúcar de tipo mucina, o aquellas con cadenas de azúcar de tipo asparagina. Se identifican moléculas de chaperona que median la unión de la cadena de azúcar para algunas cadenas de azúcar de tipo asparagina, y en algunos casos se han identificado los sitios de unión de tales cadenas de azúcar. No obstante, es difícil especificar los sitios de la introducción de las cadenas de azúcar en la síntesis. Incluso si las cadenas de azúcar se pueden introducir secuencialmente en una cadena peptídica ya sintetizada, se espera que la estructura de orden superior de la cadena peptídica se vea tremendamente alterada debido a la unión del azúcar. De este modo, no hay ninguna garantía de que la cadena peptídica forme la estructura de orden superior nativa mediante replegamiento.

Mientras tanto, restringido a glucoproteínas de tipo mucina, la cadena peptídica forma una estructura de orden superior mediante plegamiento, y después sufre una modificación con la cadena de azúcar. Por lo tanto, la cadena de azúcar se puede unir a la cadena peptídica, con la estructura tridimensional y funciones mantenidas de la proteína. De este modo, la cadena de azúcar se puede introducir con poca pérdida de la estructura de orden superior general de la cadena peptídica (M. Fukuda, Mucin-type Sugar Chain, p. 35-56, Y. Kohata, S. Hakomori, y K. Nagai ed., “Diverse World of Sugar Chain” (en Japonés), Kodansha Scientific, Ltd., 1993). De este modo, parece que las glucoproteínas de tipo mucina tienen ventajas en el uso para el desarrollo de fármacos. Sin embargo, se encuentra que las secuencias de aminoácidos de los sitios de unión en glucoproteínas de tipo mucina actualmente conocidas no tienen ninguna regla, y esto hace difícil introducir una cadena de azúcar en una posición pretendida. Además, aunque las glucoproteínas de tipo mucina tienen una estructura primaria relativamente simple, también es difícil sintetizar las glucoproteínas de tipo mucina completas mediante un enfoque de química orgánica sintética. Por estas razones, parece que todavía no se ha desarrollado un enfoque industrial para suministrar glucoproteínas de tipo mucina en grandes cantidades, aunque las glucoproteínas de tipo mucina tienen muchas características superiores.

Un método de filtración en gel, también denominado croma de exclusión de tamaños (SEC), se ha usado ampliamente durante un largo tiempo como un enfoque conveniente y exacto para medir los pesos moleculares de compuestos poliméricos. Este método se ha usado no sólo como análisis usando columnas abiertas, sino también como cromatografía de líquidos de altas prestaciones, y también permite el fraccionamiento basándose en los pesos moleculares, particularmente el fraccionamiento automático (A. Fallon, R. F. G. Booth, L. D. Bell, traducido por T. Osawa, High-Performance Liquid Chromatography, Biochemical Experimental Method 9 (en Japonés), Capítulo 5, Tokyo Kagaku Dojin Co., Ltd. 1989). Sin embargo, es técnicamente difícil determinar el valor absoluto del peso molecular de una sustancia desconocida sólo llevando a cabo estas medidas. Específicamente, hay dos requisitos: que se use un soporte de columna, con lo cual se asegura que la filtración en gel se puede realizar con una buena reproducibilidad según una curva de calibración teórica, y que se use un marcador de peso molecular estándar exacto. De este modo, la combinación de una sustancia de ensayo y un soporte de columna,... [Seguir leyendo]

1. Glucoproteína de tipo mucina que presenta una estructura repetida que comprende 3 a 2000 unidades que se repiten, teniendo cada una, una secuencia de aminoácidos representada por la fórmula I: Val-Xaa-Glu-Thr-Thr-Ala-Ala-Pro (I)

[en la que Xaa representa Val o Ile], en la que uno o más restos de aminoácidos en la estructura están unidos a una cadena de azúcar que consiste en uno o más monosacáridos.

2. Glucoproteína de tipo mucina según la reivindicación 1, en la que la glucoproteína de tipo mucina tiene una estructura repetida que comprende 3 a 700 unidades que se repiten.

3. Glucoproteína de tipo mucina según la reivindicación 1 ó 2, en la que la glucoproteína de tipo mucina tiene una estructura repetida que comprende 40 a 180 unidades que se repiten.

4. Glucoproteína de tipo mucina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que las unidades que se repiten están unidas directamente entre sí, o están unidas vía un ligador o ligadores.

5. Glucoproteína de tipo mucina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el resto de aminoácido unido a una cadena de azúcar es treonina (Thr).

6. Glucoproteína de tipo mucina según la reivindicación 5, en la que el 98% o más de los restos de aminoácidos unidos a una cadena de azúcar es treonina (Thr).

7. Glucoproteína de tipo mucina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la cadena de azúcar comprende un monosacárido seleccionado de entre el grupo constituido por N-acetilgalactosamina, galactosa, Nacetilglucosamina, ácido siálico, arabinosa, y fucosa.

8. Glucoproteína de tipo mucina según la reivindicación 7, en la que la cadena de azúcar comprende Nacetilgalactosamina.

9. Glucoproteína de tipo mucina según la reivindicación 7 u 8, en la que la cadena de azúcar comprende Nacetilgalactosamina y galactosa.

10. Glucoproteína de tipo mucina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que se suprimen uno o varios aminoácidos en el término N de la estructura que se repite.

11. Glucoproteína de tipo mucina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que la glucoproteína de tipo mucina es como se extrae a partir de una medusa.

12. Método para producir una glucoproteína de tipo mucina según la reivindicación 1, que comprende las siguientes etapas que consisten en: cortar las porciones sólidas de una medusa; extraer los cortes de la medusa con una disolución salina; separar mediante centrifugación mucina bruta del extracto; extraer con etanol la mucina bruta; separar mediante centrifugación un precipitado obtenido de la extracción; disolver en agua el precipitado; separar un sobrenadante mediante centrifugación y diálisis; y

purificar una glucoproteína de tipo mucina según la reivindicación 1, en el que todas las etapas se llevan a cabo a 0 a 25ºC.

13. Composición que comprende una glucoproteína de tipo mucina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

14. Composición según la reivindicación 13, para uso en la protección de células y tejidos, en la retención o absorción de humedad sobre la superficie de la piel, en la promoción de la salud, en la administración de fármacos,

en el tratamiento o prevención de enfermedades, o en aplicaciones antibacterianas.

15. Composición según la reivindicación 13 ó 14, en la que la composición está en forma de una disolución acuosa, membrana, o resina.

16. Método para modificar una glucoproteína de tipo mucina, que comprende modificar la cadena de azúcar de una glucoproteína de tipo mucina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 mediante la acción de glucosiltransferasa.

17. Proteína que tiene una estructura repetida que comprende 1 a 2000 unidades que se repiten, teniendo cada una una secuencia de aminoácidos representada por la fórmula I:

Val-Xaa-Glu-Thr-Thr-Ala-Ala-Pro (I) [en la que Xaa representa Val o Ile].

18. Método para producir una glucoproteína, caracterizado porque comprende la unión de por lo menos un resto de aminoácido en una proteína según la reivindicación 17 a una cadena de azúcar que consiste en uno o más monosacáridos.

19. Marcador de peso molecular que comprende una glucoproteína de tipo mucina y que tiene medianas de distribución de pesos moleculares y distribución molecular según se mide mediante un método para determinar el peso molecular absoluto, teniendo la glucoproteína de tipo mucina una estructura repetida que comprende 3 a 2000 unidades que se repiten, teniendo cada una una secuencia de aminoácidos representada por la fórmula I:

Val-Xaa-Glu-Thr-Thr-Ala-Ala-Pro (I)

[en la que Xaa representa Val o Ile],

en la que uno o más restos de aminoácidos en la estructura están unidos a una cadena de azúcar que consiste en uno o más monosacáridos.

20. Marcador de peso molecular según la reivindicación 19, en el que el marcador de peso molecular tiene un peso molecular de 10 a 1.400 kDa.

21. Marcador de peso molecular según la reivindicación 19 ó 20, en el que el marcador de peso molecular se liofiliza.

22. Método para producir un marcador de peso molecular, que comprende las siguientes etapas: someter a una glucoproteína de tipo mucina a cromatografía de exclusión molecular para fraccionamiento, teniendo la glucoproteína de tipo mucina una estructura repetida que comprende 3 a 2000 unidades que se repiten, teniendo cada una una secuencia de aminoácidos representada por la fórmula I:

Val-Xaa-Glu-Thr-Thr-Ala-Ala-Pro (I) [en la que Xaa representa Val o Ile], en la que uno o más restos de aminoácidos en la estructura están unidos a una cadena de azúcar que

consiste en uno o más monosacáridos; recoger y purificar las fracciones resultantes; y medir los pesos moleculares absolutos de las fracciones purificadas.

23. Método según la reivindicación 22, que comprende además la etapa de liofilizar las fracciones purificadas.