GLICOSAMINOGLICANOS DERIVADOS DEL POLISACÁRIDO K5 QUE TIENEN ALTA ACTIVIDAD ANTITROMBINA Y PROCEDIMIENTO PARA SU PREPARACIÓN.

Glicosaminoglicanos derivados del polisacárido K5 que tienen alta actividad antitrombina y procedimiento para su preparación. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los glicosaminoglicanos, tales como heparina, heparán sulfato, dermatán sulfato, condroitín sulfato y ácido hialurónico, son biopolímeros extraídos industrialmente de diferentes órganos de animales. En particular, la heparina, obtenida principalmente mediante extracción de la mucosa intestinal de cerdo o pulmón bovino, es una mezcla de cadenas que consiste en unidades de repetición de disacárido formadas por un ácido urónico (ácido L-idurónico o ácido D-glucurónico) y por un aminoazúcar (glucosamina), unidos mediante enlaces -14 o ß- 14. La unidad de ácido urónico puede sulfatarse en la posición 2 y la unidad de glucosamina se somete a N- acetilación o N-sulfatación y 6-O-sulfatación. Además, la glucosamina puede contener un grupo sulfato en la posición 3 en una cantidad de aproximadamente el 0,5%. La heparina es un copolímero polidisperso con un peso molecular que oscila entre aproximadamente 3.000 y aproximadamente 30.000 D. La biosíntesis natural de heparina en mamíferos y las propiedades de este producto se han descrito por Lindahl et.al. 1986 en Lane D. y Lindahl U. (Eds.) Heparin-Chemical and Biological Properties; Clinical Application, Edward Arnold. Londres, espacio entre páginas 159-190; y Lindahl U., Feingold, D.S. y Rodén L. (1986) TIBS, 11, 221-225. La secuencia formada por la región de pentasacárido de unión para antitrombina III (ATIII) denominada pentasacárido activo, que es la estructura necesaria para la unión de alta afinidad de la heparina a ATIII, es fundamental para la actividad de la heparina. Esta secuencia contiene una unidad de glucosamina sulfatada en la posición 3, que no está presente en las otras partes de la cadena de heparina. Además de la actividad a través de ATIII, la heparina ejerce su actividad anticoagulante y antitrombótica a través la activación del cofactor II de heparina (HCII) y una inhibición de trombina selectiva. Se sabe que la secuencia de sacáridos mínima necesaria para la activación de HCII es una cadena que contiene al menos 24 monosacáridos (Tollefsen D.M., 1990 Seminars in Thrombosis and Haemostasis 16, 66-70). DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA ANTERIOR Se sabe que el polisacárido K5 capsular aislado de la cepa de Escherichia coli, descrito por Varm W.F., Schmidt MA, Jann B., Jann K. (1981) en European Journal of Biochemistry 116, 359-364, muestra la misma secuencia de heparina y precursor de heparán sulfato (N-acetilheparosano), concretamente una mezcla de cadenas constituida por estructuras de repetición del disacárido glucuronil ß-1 4-glucosamina. Este compuesto se modificó químicamente tal como se describe por Lormeau et al. en la patente estadounidense n.º 5.550.116 finalizada por Casu et al. en Carbohydrate Research. 1994, 263, 271-284 o se modificó química y enzimáticamente con el fin de obtener productos que muestran actividades biológicas in vitro en la coagulación del mismo tipo de la heparina tal como se extrae de órganos de animales. La modificación química y enzimática del polisacárido K5 se describió por primera vez en el documento IT 1230785, en el que el polisacárido K5 (a continuación en el presente documento denominado también simplemente K5) se somete a (a) una N-desacetilación y una N-sulfatación; (b) una epimerización en C5 enzimática de las unidades glucurónicas; (c) una 2-O y/o 6-O-sulfatación; y (d) una 3-O-sulfatación enzimática opcional, pero este método no proporciona productos que tienen una actividad satisfactoria con respecto a la de la heparina tal como se extrae de órganos de animales, denominada a continuación en el presente documento heparina comercial o heparina convencional, designando la última expresión la cuarta norma internacional para heparina. El documento WO 92/17507 da a conocer un método para preparar productos similares a heparina partiendo de K5 mediante (a) N-desacetilación y N-sulfatación, (b) epimerización en C5, y (c) O-sulfatación, siendo la etapa (c) opcionalmente seguida por una N-resulfatación. Según este método, la cantidad del ácido idurónico del producto resultante es bajo (aproximadamente el 20% del contenido global en ácidos urónicos). Los documentos WO 96/14425 y US 5.958.899 dan a conocer un método mejorado para la preparación de productos similares a heparina que tienen un alto contenido en ácido idurónico, partiendo de K5, mediante (a) N-desacetilación y N-sulfatación, (b) epimerización mediante una C5 epimerasa, y (c) sulfatación de al menos algunos grupos hidroxilo libres, realizándose la etapa (b) en condiciones controladas. Los productos obtenidos según este método carecen de una cantidad considerable de grupos N-sulfato, perdidos durante la O-sulfatación. Los documentos WO 97/43317 y US 6.162.797 dan a conocer derivados de K5 que tienen alta actividad anticoagulante que se preparan sometiendo K5 a (a) N-desacetilación y N-sulfatación, (b) epimerización en C5, (c) O-sobresulfatación del producto epimerizado, transformado previamente en una sal del mismo con una base orgánica, y diálisis, y (d) Nresulfatación. Los productos obtenidos según este método muestran una muy alta actividad anticoagulante global. 2   El documento WO 98/42754 da a conocer un método para la preparación de glicosaminoglicanos, incluyendo derivados de K5, que tienen alta actividad antitrombótica, consistiendo dicho método, en el caso de K5, en (a) N-desacetilación y N-sulfatación, (b) epimerización mediante C5 epimerasa, (c) O-sobresulfatación, (d) O-desulfatación solvolítica parcial de una sal del producto sobresulfatado, (e) N-resulfatación, y, opcionalmente, (f) O-resulfatación. Se esperaba que esta 6-O-resulfatación opcional, que reestablece la 6-O-sulfatación completa, aumentase adicionalmente la actividad anti-Xa (A. Naggi et al., Seminars in Thrombosis and Haemostasis, 2001, 27/5, 437-443). En realidad, los productos obtenidos según este método tienen la desventaja de carecer o bien de grupos O-sulfato cuando no se realiza la etapa (f) de Oresulfatación opcional, o bien de grupos N-sulfato, que se pierden cuando se realiza la etapa (f). Por tanto, la N- u O-, especialmente la 6-O-sulfatación incompleta (siempre inferior al 60%) implica, en el caso del polisacárido K5 epimerizado en C5, valores de anti-Xa muy bajos, dando así una razón anti-Xa/TTPa muy baja en el caso de N- sulfatación incompleta, o antitrombina o HCII bajos en el caso de 6-O-sulfatación incompleta, dando así razones anti- IIa/TTPa y/o HCII/TTPa bajas. SUMARIO DE LA INVENCIÓN Se han descubierto nuevos glicosaminoglicanos derivados del polisacárido K5 de Escherichia coli con un peso molecular de desde 3.000 hasta 30.000, que contienen desde el 25% hasta el 50% en peso de las cadenas con alta afinidad por ATIII y con una alta actividad anticoagulante y antitrombótica. Dichos glicosaminoglicanos se sintetizan a través de un procedimiento que comprende en secuencia sustancialmente las siguientes etapas: (i) N-desacetilación/N-sulfatación del polisacárido K5, (ii) epimerización en C5 parcial del grupo carboxilo del resto de ácido glucurónico para dar el resto de ácido idurónico correspondiente, (iii) sobresulfatación, (iv) O-desulfatación selectiva, (v) 6-O-sulfatación selectiva opcional, y (vi) N-sulfatación. Además, se ha encontrado que, llevando a cabo la O-desulfatación del producto obtenido al final de la etapa (iii) durante un periodo de tiempo de desde 135 hasta 165 minutos, se obtienen nuevos compuestos que muestran la mejor actividad antitrombótica y una hemorragia potencial inferior a la de cualquier otro glicosaminoglicano similar a heparina. Se ha encontrado particularmente que pueden obtenerse nuevos glicosaminoglicanos que tienen una actividad antitrombina muy alta y una hemorragia potencial inferior a la de heparina mediante un procedimiento que comprende secuencialmente (i) N-desacetilación/N-sulfatación del polisacárido K5, (ii) epimerización en C5 parcial del grupo carboxilo del resto de ácido glucurónico para dar el resto de ácido idurónico correspondiente, (iii) sobresulfatación, (iv) tiempo y temperatura controlados, O-desulfatación selectiva, (v) 6-O-sulfatación, (vi) N-sulfatación, y también comprende una etapa de despolimerización opcional al final de una de las etapas (ii)-(vi). Debido a esta secuencia de reacciones, estos glicosaminoglicanos novedosos están casi completamente N-sulfatados y altamente 6-O-sulfatados, siendo por tanto diferentes de los obtenidos mediante los métodos descritos previamente. Más particularmente, se ha encontrado sorprendentemente que, si en la etapa (iv) del procedimiento anterior la Odesulfatación selectiva del producto obtenido al final de la etapa (iii) se lleva a cabo en una mezcla de... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la preparación de glicosaminoglicanos K5 que comprende las etapas de (i) N-desacetilación/Nsulfatación del polisacárido K5, (ii) epimerización en C5 parcial del grupo carboxilo del resto de ácido glucurónico para dar el resto de ácido idurónico correspondiente, (iii) sobresulfatación, (iv) O-desulfatación selectiva, (v) 6-O-sulfatación opcional, y (vi) N-sulfatación, en el que la etapa (iv) comprende tratar el producto sobresulfatado obtenido al final de la etapa (iii) con una mezcla de metanol/dimetilsulfóxido durante un periodo de tiempo de desde 135 hasta 165 minutos. 2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho periodo de tiempo es de aproximadamente 150 minutos. 3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho tratamiento se realiza durante un periodo de tiempo de 150 minutos a una temperatura de 60ºC. 4. Procedimiento para la preparación de glicosaminoglicanos novedosos, que comprende (i) hacer reaccionar el polisacárido K5 con un agente de N-desacetilación, luego tratar el producto N-desacetilado con un agente de N-sulfatación; (ii) someter el K5-N-sulfato así obtenido a una epimerización en C5 mediante la glucuronosil C5 epimerasa para obtener un K5-N-sulfato epimerizado en C5 en el que la razón glucurónico/idurónico es desde 60/40 hasta 40/60; (iii) convertir el K5-N-sulfato epimerizado en C5, que tiene un contenido del 40 al 60% en ácido idurónico con respecto a los ácidos urónicos totales, en una sal terciaria o cuaternaria del mismo, luego tratar la sal así obtenida con un agente de O-sulfatación en un disolvente polar aprótico a una temperatura de 40-60ºC durante 10-20 horas; (iv) tratar una sal con una base orgánica del producto O-sobresulfatado así obtenido con una mezcla de dimetilsulfóxido/metanol a 50-70ºC durante 135-165 minutos; (v) tratar una sal con una base orgánica del producto parcialmente O-desulfatado así obtenido con un agente de Osulfatación a una temperatura de 0-5ºC; (vi) tratar el producto así obtenido con un agente de N-sulfatación; sometiéndose opcionalmente cualquier producto obtenido al final de una de las etapas (ii) a (vi) a una despolimerización. 5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que se usa un K5 purificado previamente como material de partida. 6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 4 y 5, en el que, en la etapa (i), se usa hidrazina o una sal de la misma o un hidróxido de metal alcalino como agente de N-desacetilación y se usa el producto de adición piridina.trióxido de azufre o trimetilamina.trióxido de azufre como agente de N-sulfatación. 7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 4-6, en el que, en la etapa (ii), dicha epimerización en C5 se realiza usando la enzima glucuronosil C5 epimerasa en disolución o en forma inmovilizada en presencia de cationes divalentes. 8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que dichos cationes divalentes comprenden al menos uno de Ba, Ca, Mg y Mn. 9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 4-8, en el que, en la etapa (ii), dicha epimerasa comprende glucuronosil C5 epimerasa recombinante, glucuronosil C5 epimerasa de mastocitoma murino y glucuronosil C5 epimerasa extraída de hígado bovino. 10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 4-9, en el que se realiza dicha epimerización en C5 con la enzima en su forma inmovilizada y comprende hacer recircular 20-1.000 ml de una disolución de Hepes 25 mM a pH de desde 6 hasta 7,4 que contiene 0,001-10 g de K5-N-sulfato y uno de dichos cationes a una concentración de entre 10 y 60 mM a través de una columna que contiene desde 1,2 x 10 7 hasta 3 x 10 11 cpm de la enzima inmovilizada en un soporte inerte. 11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 4-9, en el que dicho pH es de aproximadamente 7 y dicha epimerización en C5 se realiza con una enzima recombinante a una temperatura de 30ºC haciendo recircular dicha disolución con una velocidad de flujo de aproximadamente 200 ml/hora durante un tiempo de 24 horas. 12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 4-11, en el que, en la etapa (iii), se usa el producto de adición piridina.trióxido de azufre como agente de O-sulfatación. 13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 4-12, en el que, en la etapa (iv), la reacción se lleva a cabo en dimetilsulfóxido/metanol 9/1 (V/V) a 60ºC durante 150 minutos. 18   14. Procedimiento según una de las reivindicaciones 4-13, en el que se usa un K5 purificado previamente como material de partida y, en la etapa (iv), la reacción se lleva a cabo en dimetilsulfóxido/metanol 9/1 (V/V) a 60ºC durante 150 minutos. 15. Procedimiento según una de las reivindicaciones 4-14, en el que, en la etapa (v), la 6-O-sulfatación se lleva a cabo a 0-5ºC usando el producto de adición piridina.trióxido de azufre como agente de O-sulfatación. 16. Procedimiento según una de las reivindicaciones 4-15, en el que, en la etapa (vi), se usa el producto de adición piridina.trióxido de azufre o trimetilamina.trióxido de azufre como agente de N-sulfatación. 17. Procedimiento según una de las reivindicaciones 4-16, en el que el producto obtenido al final de la etapa (vi) se somete a una despolimerización con ácido nitroso seguida por una reducción con borohidruro de sodio. 18. Procedimiento según una de las reivindicaciones 4-17, en el que se usa un K5 purificado previamente como material de partida y, en la etapa (iv), la reacción se lleva a cabo en dimetilsulfóxido/metanol 9/1 (V/V) a 60ºC durante 150 minutos, y el glicosaminoglicano K5-N,O-sulfato epimerizado en C5 obtenido al final de la etapa (vi) se somete a una despolimerización con ácido nitroso seguida por una reducción con borohidruro de sodio. 19. Procedimiento según una de las reivindicaciones 4-18, en el que el glicosaminoglicano así obtenido se aísla en forma de su sal de sodio. 20. Procedimiento según la reivindicación 19, en el que dicha sal de sodio se convierte adicionalmente en otra sal. 21. Procedimiento según la reivindicación 20, en el que dicha otra sal es otra sal de metal alcalino, o metal alcalinotérreo, amonio, trialquil(C1-C4)amonio, aluminio o zinc. 22. Glicosaminoglicano K5-N,O-sulfato epimerizado en C5 que puede obtenerse mediante un procedimiento que comprende (i) hacer reaccionar el polisacárido K5 con un agente de N-desacetilación, luego tratar el producto N-desacetilado con un agente de N-sulfatación; (ii) someter el K5-N-sulfato así obtenido a una epimerización en C5 mediante la glucuronosil C5 epimerasa para obtener un K5-N-sulfato epimerizado en C5 en el que la razón glucurónico/idurónico es desde 60/40 hasta 40/60; (iii) convertir el K5-N-sulfato epimerizado en C5, que tiene un contenido del 40 al 60% en ácido idurónico con respecto a los ácidos urónicos totales, en una sal terciaria o cuaternaria del mismo, luego tratar la sal así obtenida con un agente de O-sulfatación en un disolvente polar aprótico a una temperatura de 40-60ºC durante 10-20 horas; (iv) tratar una sal con una base orgánica del producto O-sobresulfatado así obtenido con una mezcla de dimetilsulfóxido/metanol a 50-70ºC durante 135-165 minutos; (v) tratar una sal con una base orgánica del producto parcialmente O-desulfatado así obtenido con un agente de Osulfatación a una temperatura de 0-5ºC; (vi) hacer reaccionar el producto así obtenido con un agente de N-sulfatación; sometiéndose opcionalmente cualquier producto obtenido al final de una de las etapas (ii) a (vi) a una despolimerización y convirtiéndose opcionalmente la sal de sodio del producto final en otra sal. 23. Glicosaminoglicano K5-N,O-sulfato epimerizado en C5 según la reivindicación 22, en el que la etapa (iv) se lleva a cabo en una mezcla de dimetilsulfóxido/metanol 9/1 (V/V) a 60ºC durante 150 minutos. 24. Glicosaminoglicano K5-N,O-sulfato epimerizado en C5 según la reivindicación 22, en el que se usa un K5 purificado previamente como material de partida y, en la etapa (iv), la reacción se lleva a cabo en dimetilsulfóxido/metanol 9/1 (V/V) a 60ºC durante 150. minutos, y el producto obtenido al final de la etapa (vi) se somete a una despolimerización con ácido nitroso seguida por una reducción con borohidruro de sodio. 25. Glicosaminoglicano constituido por una mezcla de cadenas, en el que al menos el 90% de dichas cadenas tienen la fórmula I 19   en la que el 40-60% de las unidades de ácido urónico son las del ácido idurónico, n es un número entero desde 3 hasta 100, R, R1, R2 y R3 representan un átomo de hidrógeno o un grupo SO3 - y siendo desde aproximadamente el 65% hasta aproximadamente el 50% de R, R1, R2 y R3 hidrógeno y siendo el resto grupos SO3 - distribuidos de la siguiente forma - R3 es desde aproximadamente el 85% hasta aproximadamente el 95% de SO3 - ; - R2 es desde aproximadamente el 17 hasta aproximadamente el 21% de SO3 - ; - R1 es desde aproximadamente el 15 hasta aproximadamente el 35% de SO3 - en unidades idurónicas y del 0 al 5% de SO3 - en unidades glucurónicas; - R es desde aproximadamente el 20 hasta aproximadamente el 40% de SO3 - en unidades glucurónicas y del 0 al 5% de SO3 - en unidades idurónicas; - la suma del porcentaje de SO3 - en R1, unidades glucurónicas, y en R, unidades idurónicas, es desde el 3 hasta el 7%; no siendo R1 y R simultáneamente SO3 - y siendo ambos hidrógeno en el 25-45% de las unidades de ácido urónico; siendo el grado de sulfatación desde aproximadamente 2,3 hasta aproximadamente 2,9, y siendo el catión correspondiente uno química o farmacéuticamente aceptable. 26. Glicosaminoglicano según la reivindicación 25, en el que dicho catión correspondiente es un ión de metal alcalino, metal alcalinotérreo, aluminio o zinc. 27. Glicosaminoglicano según la reivindicación 25, en el que dicho catión correspondiente es ión sodio o calcio. 28. Glicosaminoglicano según una de las reivindicaciones 25-27, en el que desde aproximadamente el 60% hasta aproximadamente el 55% de R, R1, R2 y R3 son hidrógeno y el resto son grupos SO3 - para un grado de sulfatación desde aproximadamente 2,4 hasta aproximadamente 2,7. 29. Glicosaminoglicano según una de las reivindicaciones 25-28, en el que al menos el 80% de dichas cadenas en dicha mezcla de cadenas tienen la fórmula I en la que n es desde 3 hasta 15. 30. Glicosaminoglicano según la reivindicación 29, en el que dichas cadenas en dicha mezcla de cadenas tienen una distribución de peso molecular que oscila entre 2.000 y 10.000, con un peso molecular medio de desde 4.000 hasta 8.000. 31. Glicosaminoglicano según la reivindicación 30, en el que dichas cadenas en dicha mezcla de cadenas tienen un peso molecular medio de desde 6.000 hasta 8.000 y al menos el 90% de dichas cadenas tienen la fórmula I, en la que el 55% de las unidades de ácido urónico son las del ácido idurónico y R3 es desde el 85% hasta el 90% de SO3 - ; R2 es aproximadamente el 20% de SO3 - ; R1 es desde el 25% hasta el 30% de SO3 - en unidades idurónicas y del 0 al 5% de SO3 - en unidades glucurónicas; R es desde el 30% hasta el 35% de SO3 - en unidades glucurónicas y del 0 a aproximadamente el 5% de SO3 - en unidades idurónicas; la suma del porcentaje de SO3 - en R1, unidades glucurónicas y en R, unidades idurónicas es el 5%; no siendo R1 y R simultáneamente SO3 - y siendo ambos hidrógeno en desde el 30% hasta el 40% de las unidades de ácido urónico; siendo el grado de sulfatación desde 2,5 hasta 2,7. 32. Glicosaminoglicano según la reivindicación 31, en el que dichas cadenas en dicha mezcla de cadenas tiene un peso molecular medio de 7.000 y al menos el 90% de dichas cadenas tienen la fórmula I, en el que aproximadamente el 55% de las unidades de ácido urónico son las del ácido idurónico y   - R3 es el 85% de SO3 - ; - R2 es el 20% de SO3 - ; - R1 es el 25% de SO3 - en unidades idurónicas y del 0 al 5% de SO3 - en unidades glucurónicas; - R es el 30% de SO3 - en unidades glucurónicas y del 0 al 5% de SO3 - en unidades idurónicas; - la suma del porcentaje de SO3 - en R1, unidades glucurónicas y en R, unidades idurónicas, es el 5%; no siendo R1 y R simultáneamente SO3 - y siendo ambos hidrógeno en el 40% de las unidades de ácido urónico; siendo el grado de sulfatación 2,55. 33. Glicosaminoglicano según la reivindicación 32, en el que dicha mezcla de cadenas tiene un peso molecular medio de 7.400. 34. Glicosaminoglicano según una de las reivindicaciones 25-28, en el que al menos el 80% de dichas cadenas en dicha mezcla de cadenas tienen la fórmula I en la que n es desde 20 hasta 100. 35. Glicosaminoglicano según la reivindicación 34, en el que dicha mezcla de cadenas tiene una distribución de peso molecular que oscila entre 9.000 y 60.000, con un peso molecular medio de desde 12.000 hasta 30.000. 36. Glicosaminoglicano según la reivindicación 35, en el que dichas cadenas en dicha mezcla de cadenas tienen un peso molecular medio de 14.000-16.000 y al menos el 90% de dichas cadenas tienen la fórmula I, en la que el 55% de las unidades de ácido urónico son las del ácido idurónico y - R3 es desde el 85% hasta el 90% de SO3 - ; - R2 es el 20% de SO3 - , - R1 es desde el 25% hasta el 30% de SO3 - en unidades idurónicas y del 0 al 5% de SO3 - en unidades glucurónicas; - R es desde el 30% hasta el 35% de SO3 - en unidades glucurónicas y del 0 al 5% de SO3 - en unidades idurónicas; - la suma del porcentaje de SO3 - en R1, unidades glucurónicas y en R, unidades idurónicas, es el 5%; no siendo R1 y R simultáneamente SO3 - y siendo ambos hidrógeno en desde el 30% hasta el 40% de las unidades de ácido urónico; siendo el grado de sulfatación desde 2,5 hasta 2,7. 37. Glicosaminoglicano según la reivindicación 36, en el que dicha mezcla de cadenas tiene un peso molecular medio de 15.700. 38. Composición farmacéutica que comprende una cantidad farmacológicamente eficaz de un glicosaminoglicano según una de las reivindicaciones 22-37, como una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como principio activo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 39. Uso de un glicosaminoglicano según una de las reivindicaciones 22-37 para la preparación de composiciones farmacéuticas para controlar la coagulación en un mamífero. 40. Uso de un glicosaminoglicano según una de las reivindicaciones 22-37 para la preparación de composiciones farmacéuticas para prevenir o tratar trombosis en un mamífero. 41. Uso según una de las reivindicaciones 39-40, en el que dicha composición farmacéutica contiene de 5 a 100 mg de dicho glicosaminoglicano. 21   Figura 1 22   Figura 2 23   Figura 3 24   Figura 4   Figura 5 26   Figura 6 27   Figura 7 28   Figura 8 29   Figura 9   Figura 10 31