Proceso para la preparación de un sulfato de glucosaminoglucano a partir de un N-acetilheparosano,

que comprende las siguientes etapas:

a)N-desacetilación y N-sulfatación de un polisacárido N-acetilheparosano aislado de una cepa bacteriana natural o recombinante, en el que dicho polisacárido N-acetilheparosano se aísla de K5 de E. coli;

b)epimerización enzimática mediante la enzima glucuronil C5-epimerasa;

c)O-sulfatación parcial combinada con O-desulfatación parcial;

d)6O-sulfatación parcial;

e)N-resulfatación

que comprende además una etapa de despolimerización controlada efectuada como alternativa después de la etapa b), c) o d) y

en el que dicho proceso se caracteriza por el hecho de que la O-sulfatación parcial en la etapa c) se efectúa durante menos de 10 horas y con una relación molar entre el agente sulfatante y el N-acetilheparosano menor o igual a 5, y por el hecho de que la 6O-sulfatación parcial (etapa d) se efectúa durante un tiempo menor o igual a 2 horas y usando una relación molar entre agente sulfatante y grupos hidroxilo de N-acetilheparosano menor o igual a 2

Derivados polisacáridos con alta actividad antitrombótica en plasma.

Campo de la invención

El campo de la invención es la preparación de polisacáridos sulfatados con actividad antitrombótica anticoagulante a partir de polisacáridos de origen microbiano.

Técnica anterior

La heparina natural es un polímero que tiene estructura de glucosaminoglucano, con pesos moleculares variables entre 3.000 y 30.000 Da, constituido por la secuencia de unidades disacáridas repetidas constituidas por ácido urónico (L-idurónico o D-glucurónico) y un aminoazúcar (glucosamina) unidas entre sí por enlaces ß-1,4. El ácido urónico puede estar sulfatado en posición 2 y la glucosamina puede estar N-acetilada o N-sulfatada y 6O-sulfatada. Además, la glucosamina puede contener también un grupo sulfato en posición 3.

Estos sustitutos son esenciales para la creación de la región de unión con alta afinidad a antitrombina (ATIII) y para explicar la actividad anticoagulante y antitrombótica del polímero.

La heparina es el agente anticoagulante y antitrombótico básico para uso terapéutico e, incluso actualmente, se obtiene mediante la extracción de órganos animales. En un intento por sustituir esta fuente de suministro y, por lo tanto satisfacer los requisitos materiales crecientes, eliminando a la vez cualquier contaminación accidental con agentes infecciosos, principalmente virus o priones, se han desarrollado en los últimos años diversos procesos para la preparación de moléculas con estructura similar a heparina así como características parecidas, partiendo de polisacáridos de N-acetilheparosano que tienen origen bacteriano y, por lo tanto, están disponibles sin límite de cantidad.

El polisacárido de N-acetilheparosano aislado de unos pocos K5 de Escherichia coli naturales o recombinantes o disoluciones madre bacterianas de Pasteurella multocida, tiene la misma estructura básica que el precursor de heparina natural constituido por una secuencia repetida de ácido D-glucurónico y N-acetilglucosamina unidas entre sí por enlaces a-1,4. El enlace entre las unidades disacáridos es, por el contrario, ß-1,4.

El ácido urónico puede estar sulfatado en dos posiciones diferentes y la glucosamina puede estar N-acetilada o N-sulfatada y 6O-sulfatada. Además, la glucosamina puede contener también un grupo sulfato en posición 3.

El polisacárido N-acetilheparosano aislado de K5 de E. coli (Vann W.F., Schmidt M.A., Jann B., Jann K. (1981) en Eur. J. Biochem. 116, 359-364) se ha modificado químicamente como se describe por Lormeau y col. en la patente de EE.UU. nº 5.550.116 y por Casu y col. (Carb. Res. 263-1994-271-284) o química y enzimáticamente en un intento de obtener productos dotados de una actividad biológica comparable a la de heparina extractiva.

Además, los productos semisintéticos deben experimentar un proceso de despolimerización para reducir el peso molecular que hace al producto más adecuado en las diferentes aplicaciones terapéuticas, en particular mejora la biodisponibilidad y reduce el riesgo de hemorragia asociado a su uso y otros efectos secundarios.

Las modificaciones químicas y enzimáticas del polisacárido bacteriano se describen, por ejemplo, en la patente italiana nº IT1230785, en la que el polisacárido K5 se N-desacetila y N-sulfata y experimenta entonces epimerización enzimática en C5 del ácido glucurónico. Estas transferencias están seguidas por otras transferencias de sulfatación enzimática tanto en ácido urónico como el aminoazúcar.

La solicitud de patente WO92/17509 describe un procedimiento para la preparación de productos similares a heparina a partir del polisacárido K5 mediante pasos de N-desacetilación, N-sulfatación y epimerización enzimática en C5, seguidos de O-sulfatación química y opcionalmente N-sulfatación.

La solicitud de patente WO 96/14425 y la patente de EE.UU. nº 5.958.899 describen un procedimiento para la preparación de derivados del polisacárido K5 que tienen un alto contenido de ácido idurónico obtenidos mediante N-desacetilación y N-sulfatación, epimerización enzimática a ácido idurónico de más del 50% del ácido glucurónico usando tampones modificados para obtener una viscosidad crítica, seguido de sulfatación de al menos algunos de los grupos hidroxilo libres del ácido urónico y de los grupos glucosamina.

La solicitud de patente WO97/433117 y la patente US 6.162.797 describen la preparación de derivados de K5 con altas actividades anticoagulantes y antitrombóticas obtenidos mediante N-desacetilación y N-sulfatación, epimerización enzimática del ácido glucurónico y O-supersulfatación y N-resulfatación.

La solicitud de patente WO 98/42754 y la patente US nº 6.197.943 y Naggi A. y col. Carbohydrate Research 336 (2001); 283-290, describen una metodología para la preparación de glucosaminoglucanos sulfatados, incluyendo derivados del polisacárido K5 que tienen alta actividad antitrombótica in vitro, mediante desulfatación solvolítica de precursores supersulfatados y 6O-resulfatación opcional.

Las solicitudes de patente WO 0172848 y WO 02/50125 describen un procedimiento de preparación de derivado de glucosaminoglucanos a partir del polisacárido K5 que tienen alta actividad anticoagulante y antitrombótica. El proceso comprende los siguientes pasos: a) N-desacetilación, b) N-sulfatación, c) epimerización enzimática del ácido glucurónico a ácido idurónico, d) supersulfatación, e) desulfatación química parcial, f) 6O-resulfatación selectiva opcional. El proceso se caracteriza por el uso de una enzima glucuronil C5-epimerasa en forma truncada, en disolución o inmovilizada.

Además, la solicitud de patente de EE.UU. nº 09/732.026 y Li y col. J. Biol. Chem., vol 276, 213 (2001) 20069-20077 han conducido al descubrimiento de un nuevo gen de ratón para la expresión de la enzima C5-epimerasa que contiene la secuencia adicional en el extremo N-terminal, que permite la producción de formas completas de la enzima que tienen mayor actividad/estabilidad con respecto a la anterior.

Sumario

La presente invención se refiere a un proceso para la preparación de glucosaminoglucanos sulfatados derivados a partir de N-acetilheparosano que comprende las siguientes etapas:

que comprende además una etapa de despolimerización controlada intermedia llevada a cabo como alternativa después de la etapa b), c) o d) y en el que dicho proceso se caracteriza por el hecho de que la O-sulfatación parcial en la etapa c) se lleva a cabo usando una relación molar entre agente sulfatante/hidroxilo de N-acetilheparosano menor o igual a 5, más preferiblemente menor de 2,5 o aún más preferiblemente menor de 1,5, y por que la 6O-sulfatación parcial de la etapa d) se lleva a cabo usando una relación molar entre el agente sulfatante/hidroxilo de N-acetilheparosano menor o igual a 2.

Según una realización preferida, la despolimerización intermedia se lleva a cabo después de la etapa de epimerización b).

Tanto la O-sulfatación parcial como la 6O-sulfatación parcial se llevan a cabo con agentes sulfatantes seleccionados entre: trietilamina-SO₃, trimetilamina-SO₃, piridina-SO₃ en un disolvente aprótico polar, preferiblemente no donante de grupos formilo, tal como tetrametilensulfona, 2,4-dimetilsulfolano, N,N-dimetilacetamida o N,N-dietilacetamida. Opcionalmente, el proceso comprende una etapa de selección por afinidad en una matriz que porta antitrombina III o sus fragmentos.

La invención hace referencia también a glucosaminoglucanos sulfatados K5OS6OSNS-epi obtenidos según el proceso descrito para uso farmacéutico. Estos productos se caracterizan por un grado de 6O-sulfatación mayor del 40% y comprendido preferiblemente entre 50 y 85%, muy cercano a los valores de la heparina extractiva, y por la presencia,...

1. Proceso para la preparación de un sulfato de glucosaminoglucano a partir de un N-acetilheparosano, que comprende las siguientes etapas:

que comprende además una etapa de despolimerización controlada efectuada como alternativa después de la etapa b), c) o d) y

en el que dicho proceso se caracteriza por el hecho de que la O-sulfatación parcial en la etapa c) se efectúa durante menos de 10 horas y con una relación molar entre el agente sulfatante y el N-acetilheparosano menor o igual a 5, y por el hecho de que la 6O-sulfatación parcial (etapa d) se efectúa durante un tiempo menor o igual a 2 horas y usando una relación molar entre agente sulfatante y grupos hidroxilo de N-acetilheparosano menor o igual a 2.

2. El proceso según la reivindicación 1, en el que las etapas d) y e) se efectúan en orden inverso.

3. Proceso según las reivindicaciones 1-2, en el que la despolimerización intermedia se lleva a cabo después de la etapa b) de epimerización.

4. Proceso según las reivindicaciones 1-2, en el que la O-sulfatación según la etapa c) se lleva a cabo con una relación molar entre el agente sulfatante y el N-acetilheparosano menor de 2,5.

5. Proceso según la reivindicación 4, en el que dicha relación molar es menor o igual a 1,5.

6. Proceso según las reivindicaciones 4-5, en el que se efectúa la O-sulfatación parcial (etapa d) durante un tiempo menor o igual a 6 horas.

7. Proceso según la reivindicaciones 1-6, en el que la O-sulfatación parcial (etapa d) se lleva a cabo usando una relación molar entre el agente sulfatante y los grupos hidroxilo de N-acetilheparosano menor o igual a 1,5.

8. Proceso según la reivindicación 7, en el que la 6O-sulfatación parcial ((etapa d) del proceso) se efectúa durante un tiempo menor o igual a 60 minutos.

9. Proceso según la reivindicación 8, en el que la sulfatación se lleva a cabo durante un tiempo menor o igual a 30 minutos.

10. Proceso según las reivindicaciones 1-9, caracterizado por el hecho de que comprende una etapa de selección por afinidad f) adicional sobre matrices de unión a antitrombina III o fragmentos de la misma.

11. Proceso según las reivindicaciones 1-10, en el que la sulfatación parcial según la etapa c) y la 6O-sulfatación parcial según la etapa d) se llevan a cabo usando un agente sulfatante seleccionado del grupo consistente en: trietilamina-SO₃, trimetilamina-SO₃, piridina-SO₃ en un disolvente aprótico.

12. Proceso según la reivindicación 11, en el que dicho disolvente aprótico polar no es donante de grupos formilo.

13. Proceso según la reivindicación 11, en el que dicho disolvente aprótico polar se elige entre: tetrametilensulfona, 2,4-dimetilsulfolano, N,N-dimetilacetamida o N,N-dietilacetamida.

14. Proceso según las reivindicaciones 1-13, en el que la 6O-sulfatación parcial (etapa d) se efectúa a una temperatura comprendida entre 4 y 30ºC.

15. Proceso según la reivindicación 14, en el que dicha temperatura está comprendida entre 10ºC y 25ºC.

16. Proceso según las reivindicaciones 1-15, en el que la despolimerización controlada intermedia se efectúa mediante procedimientos químicos o físicos.

17. Proceso según la reivindicación 16, en el que dichos procedimientos físicos comprenden un tratamiento con rayos gamma y en el que dichos procedimientos químicos comprenden: un tratamiento con ácido nitroso o sales del mismo, o una eliminación beta o un ácido periódico o un tratamiento con radicales libres.

18. Proceso según la reivindicación 17, en el que se efectúa la despolimerización mediante tratamiento con ácido nitroso o sales de mismo.

19. Proceso según la reivindicación 18, en el que la relación entre el ácido nitroso o sales del mismo y el polisacárido está comprendida entre 1 y 100 mg de sal por g de polisacárido, y la reacción se efectúa a una temperatura comprendida entre 4 y 10ºC.

20. Proceso según la reivindicación 19, en el que la despolimerización controlada se efectúa durante un tiempo menor de 30 minutos y en presencia de ácido nitroso o sales del mismo.

21. Proceso según la reivindicación 20, en el que la sal de ácido nitroso es nitrito de sodio.

22. Proceso según las reivindicaciones 16-21, en el que se termina la despolimerización mediante la adición de un exceso molar de borohidruro.

23. Proceso para la preparación de glucosaminoglucanos sulfatados derivados de N-acetilheparosano que comprende las siguientes etapas:

que comprende además una etapa intermedia de despolimerización controlada efectuada como alternativa después de la etapa b), c) o d)

en el que dicho proceso se caracteriza por el hecho de que la O-sulfatación parcial de la etapa c) se lleva a cabo durante un tiempo menor o igual a 10 horas y usando una relación molar entre agente sulfatante y N-acetilheparosano menor o igual a 5, y por que la 6O-sulfatación parcial (etapa d) se efectúa durante un tiempo menor o igual a 2 horas y con una relación molar entre el agente sulfatante y el N-acetilheparosano menor o igual a 2, y porque las O-sulfataciones de las etapas c) y d) se efectúan con un agente sulfatante seleccionado entre: trietilamina-SO₃, trimetilamina-SO₃ y piridina-SO₃ en un disolvente aprótico.

24. Proceso según las reivindicaciones 1-23, caracterizado por que la reacción de C5-epimerización (etapa c) se lleva a cabo a una temperatura menor de 35ºC y en el que la glucuronil C5-epimerasa extractiva o recombinante se inmoviliza en la fase estacionaria.

25. Proceso según la reivindicación 24, en el que dicha C5-epimerasa recombinante es una enzima de ratón expresada en células de insecto o levadura.

26. Proceso según la reivindicación 25, en el que dicha temperatura está comprendida entre 15 y 30ºC.

27. Proceso según la reivindicación 26, en el que dicha temperatura está comprendida entre 20 y 25ºC.

28. Proceso según la reivindicación 24, en el que la fase estacionaria es una resina poliestirénica o polimetacrílica con grupos epoxídicos o diólicos activados con CNBr y por que la inmovilización de C5-epimerasa se lleva a cabo en un tampón que comprende NaHCO₃ a una concentración de 100 a 300 mM o en tampón fosfato a una concentración de 10 a 50 mM a un pH de 7,0 a 8,3 a una temperatura comprendida entre 4 y 25ºC durante un tiempo comprendido entre 12 y 72 horas.

29. Proceso según las reivindicaciones 24-28, en el que la epimerización de la etapa c) se lleva a cabo en tampón HEPES que comprende: EDTA de 10 a 30 mM, CaCl₂ de 70 a 150 mM y con un pH de 5,5 a 8,0.

30. N-acetilheparosano modificado obtenible por el proceso según las reivindicaciones 1-29.

31. N-acetilheparosano modificado según la reivindicación 30 con un peso molecular menor o igual a 15.000 Da.

32. N-acetilheparosano modificado según la reivindicación 31 con un peso molecular comprendido entre 3.000 y 9.000 Da.

33. N-acetilheparosano modificado obtenible mediante el proceso según la reivindicación 12, caracterizado por la ausencia de grupos formilo en la molécula.

34. N-acetilheparosano modificado según las reivindicaciones 30-33, caracterizado por el hecho de que porta en el extremo reductor un residuo de 2,5-anhidromanitol sulfatado.

35. N-acetilheparosano según la reivindicación 34, en el que los grupos hidroxilo en posiciones 1, 3 y 6 del anhidromanitol están parcialmente sulfatados.

36. N-acetilheparosano según la reivindicación 35, en el que el anhidromanitol está parcialmente sulfatado en los hidroxilos en posiciones 1 y 6.

37. N-acetilheparosano K5 OS 6OS NS-epi según la reivindicación 36, en el que el grado de sulfatación de los grupos hidroxilo en posición 1 está comprendido entre 20 y 85%.

38. N-acetilheparosano K5 OS 6OS NS-epi según la reivindicación 36, en el que el grado de sulfatación de los grupos hidroxilo en posición 6 de la glucosamina es mayor de un 40%.

39. N-acetilheparosano K5 OS 6OS NS-epi según la reivindicación 38, en el que dicho grado de sulfatación está comprendido entre 50 y 85%.

40. N-acetilheparosano según la reivindicación 35, en el que el grado de sulfatación de los grupos hidroxilo en posición 3 de la glucosamina es menor de un 60%.

41. K5 OS 6OS NH₂,epi obtenible mediante el proceso según la reivindicación 23.

42. K5 OS NH2-epi obtenible mediante el proceso según la reivindicación 23, etapas a)-c).

43. N-acetilheparosano modificado según las reivindicaciones 30-40, caracterizado por una actividad anti-factor Xa medida en presencia de plasma mayor o igual a 50 UI/mg.

44. N-acetilheparosano modificado según la reivindicación 43, caracterizado por una relación entre las actividades de inhibición del factor Xa y el factor IIa mayor o igual a 1,0.

45. N-acetilheparosano modificado según la reivindicación 43, caracterizado por una actividad de activación de TFPI mayor o igual en comparación con heparinas extractivas.

46. N-acetilheparosano modificado según la reivindicación 43, caracterizado por que tiene una resistencia a heparinasa I mayor que las heparinas extractivas.

47. N-acetilheparosano modificado según la reivindicación 43, caracterizado por que inhibe la generación de las proteasas trombina y factor Xa.

48. N-acetilheparosano modificado según la reivindicación 43, caracterizado porque tiene una menor afinidad por el factor PF4 en comparación con heparinas extractivas.

49. N-acetilheparosano modificado según la reivindicación 43, caracterizado por una actividad HCII mayor que las heparinas extractivas.

50. N-acetilheparosano modificado según las reivindicaciones 43-49, caracterizado por la presencia de múltiples señales en un espectro de RMN-¹³C en exceso en comparación con las señales de anhidromanitol en la región comprendida entre 79 y 89 ppm, por la ausencia de señales a 51 a 165 ppm y por la ausencia de señales en la región de 7-9,5 ppm del espectro de RMN-¹H.

51. N-acetilheparosano modificado según las reivindicaciones 30-40 y 43-50 para uso farmacéutico.

52. Uso del producto según la reivindicación 51 para la preparación de un medicamento con actividad antitrombótica y anticoagulante similar a heparina.

53. Uso del producto según la reivindicación 51 para la preparación de un medicamento con actividad profibrinolítica y antiagregante.

54. El uso según la reivindicación 52 para la preparación de un medicamento para la profilaxis y el tratamiento de angina inestable, infarto de miocardio, trombosis venosa profunda, embolia pulmonar y eventos isquémicos.

55. Uso según las reivindicaciones 52-53 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de sepsis y de sus complicaciones tales como coagulación intravascular diseminada (CID).

56. Uso según la reivindicación 53 para la preparación de un medicamento para la profilaxis y el tratamiento de angina inestable, infarto de miocardio agudo, trombosis venosa y arterial, embolia pulmonar, eventos isquémicos o arteriosclerosis.

57. Uso según las reivindicaciones 51-52 para la preparación de un medicamento para la profilaxis y el tratamiento de eventos tromboembólicos debidos a una falta congénita o adquirida de antitrombina III.

58. Composición farmacéutica que comprende como principio activo cualquiera de los productos según las reivindicaciones 30-40 y 43-50 en combinación con excipientes y/o diluyentes adecuados.

59. Composición farmacéutica según la reivindicación 58 en una composición adecuada para administración oral.