DOSIFICACION DE UN ANALITO MEDIANTE INMUNOCROMATOGRAFIA DE MIGRACION LATERAL.

Dispositivo de determinación de un analito en una muestra líquida,

que comprende:

- un medio de difusión capilar (1), mediante migración lateral que determina una dirección de referencia (2) de difusión capilar, que comprende una zona de depósito (3) de la muestra líquida, y una zona de detección (5) del analito, dispuesta corriente abajo de dicha zona de depósito (3),

- un primer agente reactivo (4) de unión específica del analito, conjugado con un marcador visible y/o medible, libre de migrar en el estado húmedo, por difusión capilar, en el medio de difusión capilar (1), según la dirección de referencia, estando la zona de disposición del primer agente reactivo de unión confundida con la zona de depósito (3) de la muestra, o estando dispuesta corriente abajo de esta última, pero corriente arriba de la zona de detección (5),

- un segundo agente reactivo (6) de unión específica del analito, inmovilizado en la zona de detección (5),

caracterizado porque la zona de detección (5) comprende un tercer agente reactivo constituido por el analito (7), o un análogo del analito, inmovilizado, y dispuesto a distancia del segundo agente reactivo (6) de unión específica, corriente abajo de éste

Dosificación de un analito mediante inmunocromatografía de migración lateral.

La presente invención se refiere a un dispositivo inmunocromatográfico de migración lateral que permite simultáneamente la determinación de un analito en una muestra líquida mediante un ensayo sándwich y mediante un ensayo de competición.

Unos dispositivos inmunocromatográficos de migración lateral se describen por ejemplo en la patente EP 0 284 232. Estos dispositivos utilizan un medio de difusión capilar en forma de un soporte sólido poroso en el seno del cual la muestra y los agentes reactivos migran mediante difusión capilar. Estos dispositivos integran o comprenden así un soporte sólido poroso (o inmunocromatográfico) que comprende una primera zona que soporta en forma liofilizada, seca, o deshidratada, un agente reactivo de unión específica del analito conjugado con un marcador visible y/o medible, y una zona de detección en la que se inmoviliza un agente reactivo de captura específica del analito. El agente reactivo de unión específica del analito es inmóvil en forma seca, pero se vuelve móvil en el soporte sólido en el estado húmedo. Así, cuando el soporte sólido se pone en contacto con una muestra líquida, esta última migra por difusión capilar en este soporte arrastrando el agente de unión específica del analito conjugado con el marcador visible y/o medible. La muestra y el agente reactivo de unión específica del analito migran por difusión capilar en el soporte sólido hasta la zona de detección que soporta el agente reactivo de captura específico del analito inmovilizado.

Se conocen a partir del documento WO 2004/088320 unos procedimientos inmunocromatográficos en fase sólida en los que el agente reactivo de unión, conjugado con un marcador visible y/o medible se añade extemporáneamente en forma líquida.

Estos dispositivos permiten clásicamente la detección del analito, o bien mediante un ensayo sándwich, o bien mediante un ensayo de competición.

En un ensayo sándwich, el agente reactivo de unión marcado se une al analito, y este último se inmoviliza sobre el soporte sólido mediante el agente reactivo de captura. La presencia o la ausencia del analito en la muestra se mide mediante la presencia o no de una señal visible o medible, a nivel del agente reactivo de captura.

En un ensayo de competición, el analito y el agente reactivo de unión están en competición para unirse al agente reactivo de captura. La presencia o la ausencia del analito en la muestra se miden mediante la ausencia o no de una señal visible o medible, a nivel del agente reactivo de captura.

Las patentes EP 0 291 194, EP 0 560 411 y EP 0 560 410 describen unos dispositivos en los que el soporte sólido inmunocromatográfico en una sola parte es incorporado en una caja provista de una abertura para el depósito de la muestra líquida, y de una ventana de observación para la lectura del resultado.

La patente EP 1 091 808 describe unos dispositivos mejorados que comprenden asimismo un soporte sólido poroso en varias partes, con un órgano de captación de la muestra líquida, móvil, que permite una mejor recogida de la muestra.

Estos dispositivos se pueden adaptar a un uso único y doméstico. En efecto, son de un uso fácil y rápido, necesitan sólo poca manipulación puesto que todos los agentes reactivos están integrados o comprendidos en el dispositivo.

Sin embargo, estos ensayos inmunocromatográficos en fase sólida no permiten una determinación cuantitativa del analito en la muestra.

Además, en ensayo sándwich, se observa para algunos analitos un efecto "gancho" o efecto "hook". El efecto gancho es un efecto indeseable bien conocido en los ensayos inmunológicos. Se produce cuando el analito está presente en la muestra a una concentración muy elevada. El efecto gancho puede entonces provocar unos falsos negativos, que concluyen de manera aberrante en la ausencia del analito en la muestra.

Los analitos que presentan un efecto gancho durante dosificaciones inmunológicas de tipo sándwich presentan unas curvas señal/concentración de tipo curva de Gauss (véase la figura 1). La figura 1 muestra que a una señal dada (S) corresponden dos concentraciones posibles del analito (C1 y C2), una débil (C1) y la otra elevada (C2) durante la lectura del resultado a un tiempo definido.

Las curvas señal/concentración para las dosificaciones mediante competición están representadas en la figura 2. Para un ensayo mediante competición, existe efectivamente la obtención de dos señales diferentes (S1 y S2) para dos concentraciones respectivamente diferentes (C1 y C2) del analito a determinar. Sin embargo, los ensayos mediante competición muestran asimismo muy rápidamente sus límites, debido a que existe una extinción de la señal a unas concentraciones relativamente poco elevadas de analito.

Una solución comúnmente adoptada para evitar estos inconvenientes de los ensayos sándwich y de los ensayos de competición consiste en determinar el analito a partir de una gama de dilución de la muestra líquida. El uso de una gama de dilución no conviene sin embargo para un uso doméstico. Además, el uso de una gama de dilución de la muestra necesita unas manipulaciones suplementarias y un consumo aumentado de dispositivos de ensayo a uso único, puesto que cada muestra se ensaya varias veces a diferentes diluciones.

De acuerdo con el documento DE 10054093, se propone un dispositivo de inmunofiltración constituido por dos partes distintas o independientes, asignadas respectivamente a un ensayo de tipo sándwich y a un ensayo de tipo competición. Con este dispositivo, un agente reactivo de unión específica conjugado con un marcador fluorescente se mezcla extemporáneamente con el analito. La mezcla obtenida se divide después en dos porciones. Una primera porción se filtra en la parte sándwich, y reacciona con un segundo agente reactivo de unión, inmovilizado, y una segunda porción se filtra en la parte de competición del dispositivo, y reacciona con un agente reactivo de captura, inmovilizado, idéntico al analito, o un análogo del analito. Las señales fluorescentes respectivamente obtenidas permiten la determinación del analito.

Este dispositivo no es susceptible de mejorar la sensibilidad o la precisión de la determinación del analito, puesto que cada ensayo elemental trabaja con la concentración de partida del agente reactivo de unión específica.

De acuerdo con el documento US 2005/0112729 (véase en particular el párrafo 0063 y la reivindicación 1), se ha descrito un dispositivo para la determinación de un complejo entre un analito y un primer agente reactivo de unión específica, marcado, comprendiendo este dispositivo:

- un medio de difusión capilar,

- en una zona denominada de competición del medio de difusión capilar, un segundo agente reactivo de unión específica del analito, inmovilizado, y complejado con un ligando, asimismo marcado,

- en una zona denominada de detección del medio de difusión capilar; un agente reactivo de captura, inmovilizado, susceptible de unirse tanto al complejo citado anteriormente como al ligando marcado, siendo este último susceptible de ser desplazado o descomplejado en la zona de competición mediante el flujo de dicho complejo sobre el medio de difusión capilar.

La determinación del analito se obtiene a partir de las señales obtenidas en las zonas de competición y de detección.

El formato de este ensayo es complejo de utilizar, y se justifica sólo para unas determinaciones del analito de gran precisión.

El documento US-A-5.962.339 describe un ensayo que comprende una zona 5 denominada "threshold" y una zona 6 denominada "detección". El dispositivo descrito no propone simultáneamente en la misma membrana una dosificación del analito mediante sándwich y una dosificación del analito mediante competición.

La presente invención tiene por objetivo evitar los inconvenientes de los dispositivos mencionados anteriormente. En particular, la presente invención tiene por objeto, por un lado, un dispositivo de ensayo y, por otro lado, un modo de uso de este último, que permite una determinación del analito, con un grado de fiabilidad y/o de precisión suficiente, en cualquier circunstancia, es decir, sea cual sea la concentración de partida de este último, en particular cuando esta concentración es relativamente fuerte o relativamente baja.

Según la invención, haciendo referencia a la figura 3, se propone un dispositivo de determinación...

1. Dispositivo de determinación de un analito en una muestra líquida, que comprende:

- un medio de difusión capilar (1), mediante migración lateral que determina una dirección de referencia (2) de difusión capilar, que comprende una zona de depósito (3) de la muestra líquida, y una zona de detección (5) del analito, dispuesta corriente abajo de dicha zona de depósito (3),

- un primer agente reactivo (4) de unión específica del analito, conjugado con un marcador visible y/o medible, libre de migrar en el estado húmedo, por difusión capilar, en el medio de difusión capilar (1), según la dirección de referencia, estando la zona de disposición del primer agente reactivo de unión confundida con la zona de depósito (3) de la muestra, o estando dispuesta corriente abajo de esta última, pero corriente arriba de la zona de detección (5),

- un segundo agente reactivo (6) de unión específica del analito, inmovilizado en la zona de detección (5),

caracterizado porque la zona de detección (5) comprende un tercer agente reactivo constituido por el analito (7), o un análogo del analito, inmovilizado, y dispuesto a distancia del segundo agente reactivo (6) de unión específica, corriente abajo de éste.

2. Dispositivo según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende un órgano de captación de la muestra líquida independiente del medio de difusión capilar, susceptible de ser llevado en contacto con la zona de depósito, para un flujo de dicha muestra en dicha zona de depósito.

3. Dispositivo según la reivindicación 1, caracterizado porque el medio de difusión capilar (1) comprende una zona de disposición del primer agente reactivo (4) de unión, en el estado seco y libre, en o sobre dicho medio de difusión capilar.

4. Dispositivo según la reivindicación 1, caracterizado porque el segundo agente reactivo (6) de unión específica, y/o el analito (7), o el análogo del analito, están dispuestos sobre el medio de difusión capilar según una línea transversal a la dirección de referencia.

5. Dispositivo según la reivindicación 1, caracterizado porque el medio de difusión capilar comprende una zona de control (C), corriente abajo de la zona de detección (5).

6. Procedimiento de determinación de un analito en una muestra líquida mediante la utilización de un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque:

- se deposita una muestra líquida en la zona de depósito (3) del medio de difusión capilar (1),

- se espera un tiempo suficiente para la migración por difusión capilar de la muestra líquida hasta la zona de detección (5),

- se observa en la zona de detección (5) la medición en la que, por un lado, el primer agente reactivo (4) de unión específica complejado con el analito se fija al segundo agente reactivo (6) de unión específica, obteniendo una primera señal y, por otro lado, el primer agente reactivo (4) de unión no complejado se fija al tercer agente reactivo constituido por el analito (7) o un análogo del analito, obteniendo una segunda señal,

- se determina el analito a partir de las primera y segunda señales.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque la cantidad del primer agente reactivo (4) de unión es excedentaria con relación a la cantidad del analito presente en la muestra líquida, o del número de sitios de complejación presentes en dicha muestra líquida.

8. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque una concentración baja en analito se detecta mediante la ausencia de la primera señal y la presencia de la segunda señal.

9. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque una concentración importante en analito se detecta mediante la ausencia de las dos señales.