Ensayo de unión a base de partículas.

Un método para detectar la presencia o cantidad de un analito en una muestra,

comprendiendo dicho método:

(a) aplicar a una superficie porosa un primer componente de unión que comprende partículas que tienen fijada a ellas una sustancia de unión que se une específicamente a dicho analito;

(b) aplicar dicha muestra a dicha superficie porosa;

(c) aplicar a dicha superficie porosa un segundo componente de unión que comprende partículas marcadas de forma detectable; y

(d) detectar una señal producida por dichas partículas marcadas de forma detectable sobre dicha superficie porosa que es indicativa de la presencia y/o la cantidad de dicho analito en dicha muestra;

donde dicha superficie porosa es una rejilla o una parrilla;

donde dicha superficie porosa permite que dicho segundo componente de unión, pero no que dicho primer componente de unión, pase a través de dicha superficie;

donde dicho primer componente de unión y dicho analito se unen entre sí para formar un primer complejo de unión;

donde dichas partículas marcadas de forma detectable tienen fijada a ellas una sustancia de unión que se une específicamente a dicho analito o dicho primer componente de unión y dicho analito, de modo que dicho segundo componente de unión y dicho primer complejo de unión se unen entre sí para formar un segundo complejo de unión;

y

donde el primer complejo de unión y/o el segundo complejo de unión es retenido sobre la superficie porosa.

Ensayo de unión a base de partículas Campo de la invención La presente invención se refiere a la separación de un inmunocomplejo formado o cualquier complejo biomolecular de material no unido sobre una superficie porosa, que es una rejilla o parrilla y comprende agujeros/aberturas compatibles mutuamente con partículas usadas. La invención desvela un inmunoensayo heterogéneo realizado en formato de ensayo con dos partículas donde el tamaño y las diferentes características de las partículas son aprovechados, para detección y cuantificación de un analito en una muestra. En el método, se usan partículas grandes para capturar a partir de una muestra, separar y distinguir dicho analito de fluidos corporales, mientras que se usan partículas pequeñas como medio de marcado.

Antecedentes de la invención Varios métodos usan técnicas de inmunoensayo para la detección y la cuantificación de antígeno en una muestra. Actualmente se usan dos tipos de sistemas de inmunoensayo. En un sistema homogéneo, el ensayo se realiza en una única fase. En un sistema heterogéneo, el inmunoensayo se realiza en dos etapas. La etapa adicional es necesaria para separar el material unido del no unido. Típicamente, se usa una superficie de soporte sólida como una fase unida, a la que se fija un anticuerpo o antígeno mediante adsorción o enlaces químicos. Se han desarrollado muchos tipos de superficies de soporte sólidas para mejorar el rendimiento de una reacción inmunológica y la eficacia de la etapa de separación.

Se han usado partículas como una fase sólida móvil en ensayos de aglutinación para mejorar la eficiencia de la reacción inmunológica entre anticuerpo y antígeno. En dicho sistema, antígenos/anticuerpos solubles se combinarán con anticuerpos/antígenos específicos unidos sobre las partículas dando como resultado precipitados de inmunocomplejos de antígeno-anticuerpo insolubles sobre la superficie de las partículas. En inmunoensayos en fase sólida, la sensibilidad del ensayo puede incrementarse lavando el inmunocomplejo unido a la fase sólida, lo que da como resultado una separación más completa del material no unido y, por lo tanto, el incremento de la relación de señal con respecto a ruido. Adicionalmente, también se han usado micropartículas de diversas composiciones en un esfuerzo por incrementar el área superficial del soporte sólido.

Los ensayos de aglutinación a base de partículas son bien conocidos para los expertos en la materia. Los ensayos de aglutinación originales aprovechaban partículas de un único tamaño como partículas de poliestireno es decir partículas de látex. Un método para superar la baja sensibilidad del ensayo de aglutinación especialmente cuando se ensayan pequeñas cantidades de un analito se desvela en la Patente de Estados Unidos Nº 4.279.617, donde se usan dos reactivos particulados revestidos diferentes. Dichas partículas pueden ser de diferente tamaño. Dicho método no implica una separación de material no unido del aglutinado usando un proceso de filtración.

Los documentos de la técnica anterior reconocen una serie de publicaciones que desvelan técnicas de ensayo que dependen del uso de un miembro poroso tal como una membrana, filtro u otras matrices. La Patente de Estados Unidos Nº 4.632.901, el documento EP-B-180638 y la Patente de Estados Unidos Nº 4.727.019 desvelan un miembro al que está unido un receptor para el analito diana y un segundo miembro para atraer líquido añadido al primer miembro. Cuando se añade una muestra líquida, el líquido fluye a través del miembro y los receptores en éste se unen al analito presente en la muestra. Después de la adición de la muestra, se añade otro receptor para el analito que está marcado para permitir la detección. Siendo marcadores adecuados una enzima, un radionúclido o un marcador fluorescente. Cuando se usa un marcador enzimático, una desventaja es que debe añadirse a la membrana un sustrato que forma una coloración.

El documento EP-B-253579 desvela una realización adicional de la técnica basada en un miembro mencionada anteriormente. La realización aprovecha las microesferas que quedan atrapadas dentro de los intersticios de la membrana porosa para aprovechar un medio para fijar un receptor o antirreceptor al miembro poroso.

La Patente de Estados Unidos Nº 4.916.056, el documento EP-B-389003, la Patente de Estados Unidos Nº

5.008.080 y la Patente de Estados Unidos Nº 5.149.622 desvelan ensayos de flujo pasante a base de membranas que aprovechan partículas sobre las que han sido retenidos anticuerpos o antígenos. El tamaño de las partículas no es vital aunque se prefiere que el tamaño sea más pequeño que el tamaño de poro promedio de la matriz fibrosa.

Habitualmente se usan membranas tridimensionales para la separación de un inmunocomplejo de material no unido. La Patente de Estados Unidos Nº 5.501.949 desvela un inmunoensayo que usa partículas finamente divididas como una fase sólida como el primer componente (sustancia) de unión. Los segundos componentes de unión solubles están marcados con un material que genera señales. El componente de unión marcado, no unido a partículas, soluble usado en este método tiene una menor actividad específica en comparación con el componente de unión marcado con un marcador unido a partículas. Esto da como resultado la pérdida de sensibilidad del ensayo. El método usa una membrana tridimensional para filtrar el inmunocomplejo y separar el material no unido.

La Patente de Estados Unidos Nº 4.853.335 desvela un inmunoensayo donde una muestra biológica, ligando o antiligando marcado con oro coloidal, y partículas de captura de fase sólida revestidas con ligando o antiligando se aplican sobre una película porosa. Las partículas capturadas sobre la membrana son inspeccionadas visualmente para ver su color.

La solicitud de británica Nº 2123146 describe un método de ensayo realizado en un contador de células ópticoeléctrico de doble canal o en un microscopio de fluorescencia. La divulgación implica primera y segunda partículas microscópicas que tienen diferentes propiedades detectables realizando dichos métodos de ensayo. Dicha solicitud no desvela ninguna separación de material unido del aglutinado usando un proceso de filtración. Un fluido biológico se entremezcla con las partículas, y seguidamente se miden sus diferentes propiedades.

La Patente de Estados Unidos Nº 5.565.366 comprende un método donde se forma una mezcla de prueba poniendo en contacto a una muestra con partículas coloreadas que portan sobre su superficie receptores específicos para el ligando. Cuando se hace pasar a la mezcla de prueba a través de un filtro que tiene aberturas más grandes que las partículas pero más pequeñas que los agregados, los agregados se eliminan del filtrado y el color del filtro/filtrado se analiza. El documento desvela que el pequeño tamaño de partícula usado es más ventajoso con respecto a la formación de agregados que partículas más grandes usadas en técnicas de la técnica anterior. Sin embargo, el uso de partículas pequeñas es desventajoso, dado que el consumo de ligando o antiligando sobre la partícula es mayor cuanto más pequeñas son las partículas.

La Patente de Estados Unidos Nº 6.268.222 desvela un enfoque diferente donde micropartículas se fijan a nanopartículas marcadas con colorante de fluorescencia. Las partículas se fijan entre sí mediante sus grupos funcionales en superficie. Esta invención comprende una partícula central o portadora que tiene sobre su superficie una pluralidad de partículas poliméricas más pequeñas. Cuando se usan diferentes colorantes de fluorescencia, se obtiene una emisión de fluorescencia múltiple mediante una excitación de una fuente de luz. Modificando la cantidad y la relación de diferentes poblaciones de nanoesferas, es posible establecer y distinguir un gran número de poblaciones discretas de partículas portadoras con espectros de emisión únicos. Este enfoque es útil para análisis múltiple de una pluralidad de analitos en una muestra.

Tal como se ha desvelado en la anterior revisión de la técnica anterior, se han usado partículas en solitario o junto con diferentes aplicaciones de membranas tridimensionales para separar analitos deseados a partir de una muestra. Sin embargo, a menudo existe la unión inespecífica de sustancia de unión marcada debido a la porosidad de la membrana. Por lo tanto, la relación de señal con respecto a ruido es baja, debido a una elevada señal de fondo, cuando se usan membranas tridimensionales. Por lo tanto, las membranas tridimensionales requieren un lavado considerable para reducir la unión inespecífica.

Además de los métodos desvelados anteriormente, ensayos... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar la presencia o cantidad de un analito en una muestra, comprendiendo dicho método:

(a) aplicar a una superficie porosa un primer componente de unión que comprende partículas que tienen fijada a ellas una sustancia de unión que se une específicamente a dicho analito;

(b) aplicar dicha muestra a dicha superficie porosa;

(c) aplicar a dicha superficie porosa un segundo componente de unión que comprende partículas marcadas de forma detectable; y

(d) detectar una señal producida por dichas partículas marcadas de forma detectable sobre dicha superficie porosa que es indicativa de la presencia y/o la cantidad de dicho analito en dicha muestra;

donde dicha superficie porosa es una rejilla o una parrilla; donde dicha superficie porosa permite que dicho segundo componente de unión, pero no que dicho primer componente de unión, pase a través de dicha superficie; donde dicho primer componente de unión y dicho analito se unen entre sí para formar un primer complejo de unión; donde dichas partículas marcadas de forma detectable tienen fijada a ellas una sustancia de unión que se une específicamente a dicho analito o dicho primer componente de unión y dicho analito, de modo que dicho segundo componente de unión y dicho primer complejo de unión se unen entre sí para formar un segundo complejo de unión;

y donde el primer complejo de unión y/o el segundo complejo de unión es retenido sobre la superficie porosa.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde la muestra y el primer componente de unión se ponen en contacto entre sí antes de ser aplicados a la superficie. 25

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde la etapa (a) se lleva a cabo antes que la etapa (b) .

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde la muestra, el primer componente de unión y el segundo

componente de unión se ponen en contacto entre sí antes de ser aplicados a la superficie porosa. 30

5. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además aplicar a dicha superficie antes de la etapa (d) una solución de lavado capaz de pasar a través de dicha superficie porosa.

6. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho segundo componente

de unión comprende partículas marcadas de forma detectable que tienen fijada a ellas una sustancia de unión que se une específicamente a dicho analito.

7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha superficie porosa comprende: 40

(a) un material que es metal, plástico, cerámica, vidrio o silicio; y/o

(b) un dispositivo de separación.

8. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha superficie porosa 45 comprende un formato tanto bidimensional como tridimensional.

9. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde las partículas del primer componente de unión o el segundo componente de unión:

(a) comprenden un material que es un polímero sintético, plástico, vidrio, metal o celulosa; o (b) son liposomas, células o microorganismos.

10. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde las partículas del primer componente de unión tienen un diámetro promedio más grande que las partículas del segundo componente de 55 unión.

11. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde a) las partículas del primer componente de unión tienen un diámetro promedio de 0, 1 a 200 m; y/o 60 b) las partículas del segundo componente de unión tienen un diámetro promedio de 1 a 1000 nm.

12. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la superficie porosa comprende aberturas/agujeros con dos lados paralelos y la distancia entre los lados paralelos es más pequeña que el diámetro promedio de las partículas del primer componente de unión.

13. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha sustancia de unión está unida de forma adsorptiva o de forma covalente a dichas partículas en una cantidad suficiente para revestir sustancialmente las partículas.

14. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha sustancia de unión comprende un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal o fragmentos F (ab') o F (ab') 2 de los mismos.

15. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dichas partículas se marcan de forma detectable usando un material que es un material luminiscente, radiomarcado, cromógeno o magnético. 10

16. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho analito es un antígeno, opcionalmente proteína C-reactiva (CRP) o globulina fijadora de hormonas sexuales (SHBG) .

17. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha superficie porosa

tiene una naturaleza pasiva en la recogida de dichos complejos y opcionalmente tiene un papel activo en la generación y/o la conducción de señales, así como en la eliminación de marcador no unido.

18. Un kit para detectar la presencia y/o cantidad de un analito en una muestra que comprende:

(a) una superficie porosa;

(b) un primer componente de unión que comprende partículas que tienen fijada a ellas una sustancia de unión que se une específicamente a dicho analito para formar un primer complejo de unión; y

(c) un segundo componente de unión que comprende partículas marcadas de forma detectable que tienen fijada a ellas una sustancia de unión que se une específicamente a dicho analito o dicho primer componente de unión y

dicho analito, de modo que dicho segundo componente de unión y dicho primer complejo de unión se unen entre sí para formar un segundo complejo de unión; donde dicha superficie porosa es una rejilla o una parrilla; donde el primer complejo de unión y/o el segundo complejo de unión son capaces de ser retenidos sobre la superficie porosa.

19. Un kit de acuerdo con la reivindicación 18, donde dicha superficie porosa tiene una naturaleza pasiva en la recogida de dichos complejos y opcionalmente tiene un papel activo en la generación y/o la conducción de señales, así como en la eliminación del marcador no unido.