Sistemas y métodos para determinar el porcentaje de glucohemoglobina.

Una glucohemoglobina acoplada tanto con (i) un anticuerpo que reconoce hemoglobina marcada con un primer marcador detectable como con (ii) ácido borónico o un derivado del mismo marcado con un segundo marcador detectable.

Sistemas y métodos para determinar el porcentaje de glucohemoglobina La diabetes sacarina es un trastorno crónico caracterizado por deficiencia de insulina, hiperglucemia y alto riesgo de desarrollo de complicaciones en ojos, riñones, nervios periféricos, corazón y vasos sanguíneos. La enfermedad es altamente prevalente, afectando a del orden de 16 millones de personas en los EE.UU. La enfermedad es también costosa, en términos tanto de sufrimiento humano como de dólares; se estima que aproximadamente 1 de cada 7 dólares gastados en cuidados sanitarios en los EE.UU. van al cuidado de la diabetes, en su mayoría para el tratamiento de las complicaciones crónicas. En los EE.UU., la diabetes es la causa más común de ceguera en los jóvenes adultos, de insuficiencia renal y amputación de miembro no traumática.

El Ensayo de control y complicaciones de la diabetes (DCCT en inglés) completado en 1993 mostró que el riesgo de desarrollo y progresión de las complicaciones crónicas de la diabetes está estrechamente relacionado con el grado de control glucémico, como se mide mediante determinaciones de glucohemoglobina (GHb) . El DCCT proporcionó también un gran conjunto de datos que relacionan los valores de GHb con la glucosa sanguínea media. Por tanto, los resultados del DCCT han fijado el escenario para establecer objetivos de tratamiento de diabetes específicos usando GHb como índice de la concentración media de glucosa sanguínea.

Idealmente, la detección temprana de niveles de glucosa sanguínea alterados conduciría a una monitorización cuidadosa y a un control a largo plazo de las concentraciones de glucosa sanguínea. Existe la necesidad de un ensayo rápido y exacto para medir los niveles de glucosa sanguínea. Muchos ensayos de monitorización de glucosa sanguínea actuales están sometidos a una toma de alimento reciente u otras costumbres del estilo de vida que pueden causar que fluctúen drásticamente los niveles de glucosa a corto plazo. Estos pueden no dar una visión exacta de las tendencias de los niveles de glucosa sanguínea y pueden enmascarar niveles elevados en la situación inicial. Como se ha mencionado, se ha establecido anteriormente que los niveles elevados de glucosa sanguínea conducen a una glucación aumentada de la hemoglobina (Hb) en eritrocitos en circulación, y que el nivel de glucoHb está correlacionado con los niveles de glucosa durante aproximadamente un periodo de tres meses. Por lo tanto, la toma reciente de alimento tiene poco impacto sobre el nivel de glucoHb, dando por tanto un nivel más exacto de los niveles medios de glucosa sanguínea.

Se han desarrollado una variedad de ensayos de diagnóstico y dispositivos relacionados para el ensayo de diagnóstico inmediato (POC en inglés) . A la vista de la conveniencia de los ensayos de diagnóstico de tipo POC y dispositivos relacionados, la prontitud de sus resultados y la alta incidencia de la diabetes, la necesidad de un ensayo de diagnóstico temprano para el descubrimiento de la tendencia a diabetes y también de una terapia de monitorización ha destacado la extraordinaria necesidad de un ensayo de diagnóstico de tipo POC. Este está más adaptado para entornos no hospitalarios y también en situaciones en que no se requieran flebotomistas (concretamente, que no haya necesidad de extracciones de sangre) . Generalmente, los dispositivos de POC pueden ser portátiles o transportables de otro modo. En algunos casos, pueden ser incluso de mano.

Además, debido que hay mucha variabilidad en los ensayos actualmente disponibles, sería deseable proporcionar sistemas de POC que tuvieran una alta sensibilidad, precisión, exactitud y fiabilidad de medida y que sin embargo estuvieran disponibles para grandes poblaciones. La presente invención describe un método de determinación de los niveles de glucosa sanguínea mediante la medida de la cantidad de glucohemoglobina en una muestra pequeña de sangre haciendo uso de tiras reactivas cromatográficas en un sistema de ensayo que es susceptible de configuración en dispositivo de tipo POC.

El documento US 6.399.293 B1 describe un elemento de ensayo y un método para determinar la relación de glucohemoglobina a hemoglobina no glucada en una muestra.

La presente invención está basada, en parte, en el descubrimiento de metodologías para el análisis cuantitativo de hemoglobina (Hb) , glucohemoglobina (GHb) y otras variantes para ensayar. En consecuencia, la presente invención proporciona sistemas para efectuar los ensayos y métodos para determinar la cantidad de glucohemoglobina en una muestra de sangre. En algunas realizaciones, el sistema y los métodos descritos aquí pueden usarse en ensayos de diagnóstico inmediato (POC) , con dispositivos puede pueden ser portátiles e incluso de mano, y en algunos casos pueden estar accionados a pilas. En ciertas realizaciones, las metodologías descritas aquí pueden estar exentas de CLIA (en que "CLIA" hace referencia a las Enmiendas para la mejora del laboratorio clínico en inglés) .

En un aspecto de la invención, se proporciona una glucohemoglobina acoplada tanto con un anticuerpo que reconoce hemoglobina marcado con un primer marcador detectable como con un ácido borónico, o derivado del mismo, marcado con un segundo marcador detectable.

En otro aspecto de la invención, se proporciona un método para determinar el porcentaje de glucohemoglobina en una muestra, comprendiendo el método detectar un primer marcador detectable acoplado con un primer agente que se une a la hemoglobina en la muestra y un segundo marcador detectable acoplado con un segundo agente que se une solo a la glucohemoglobina en la muestra y determinar el porcentaje de glucohemoglobina en la muestra basándose en la cantidad del primer marcador detectable y del segundo marcador detectable detectada en la

muestra. Las señales del primer marcador detectable y del segundo marcador detectable pueden medirse simultáneamente, de forma opcional.

En otra realización, el método comprende detectar un primer marcador detectable acoplado con un primer agente que se une a la hemoglobina en la muestra y un segundo marcador detectable acoplado con un segundo agente, un ácido borónico o derivado del mismo, que se une solo a la glucohemoglobina en la muestra, y determinar el porcentaje de glucohemoglobina en la muestra basándose en la cantidad del primer marcador detectable y el segundo marcador detectable detectada en la muestra. Las señales del primer marcador detectable y el segundo marcador detectable pueden medirse simultáneamente, de forma opcional.

En aún otra realización, el método comprende las etapas de poner en contacto la hemoglobina liberada de las células de una muestra con un primer agente marcado con un primer marcador detectable que se une a hemoglobina, y con un segundo agente que está marcado con un segundo marcador detectable que se une solo a glucohemoglobina; inmovilizar la hemoglobina marcada detectablemente sobre un soporte sólido; medir las señales del primer marcador detectable y del segundo marcador detectable inmovilizado sobre el soporte sólido y determinar el porcentaje de glucohemoglobina en la muestra basándose en las señales del primer marcador detectable y del segundo marcador detectable. Las señales del primer marcador detectable y el segundo marcador detectable pueden medirse simultáneamente, de forma opcional.

En aun otra realización, el método comprende las etapas de poner en contacto la hemoglobina liberada de células de una muestra con un primer agente marcado con un primer marcador detectable que se une a hemoglobina, y con un segundo agente, un ácido borónico o derivado del mismo, que está marcado con un segundo marcador detectable que se une solo a glucohemoglobina; inmovilizar la hemoglobina marcada detectablemente sobre un soporte sólido; medir las señales del primer marcador detectable y del segundo marcador detectable inmovilizado sobre el soporte sólido y determinar el porcentaje de glucohemoglobina en la muestra basándose en las señales del primer marcador detectable y del segundo marcador detectable. En una realización ejemplar, se miden simultáneamente las señales del primer marcador detectable y del segundo marcador detectable.

En otra realización, el método comprende las etapas de poner en contacto la hemoglobina liberada de células de una muestra con un primer agente marcado con un primer marcador detectable que se une a hemoglobina, y con un segundo agente que está marcado con un segundo marcador detectable que se une solo a glucohemoglobina; inmovilizar la hemoglobina marcada detectablemente, incluyendo la glucohemoglobina marcada detectablemente, en la misma región sobre un soporte sólido; medir simultáneamente las señales del primer marcador detectable... [Seguir leyendo]

1. Una glucohemoglobina acoplada tanto con (i) un anticuerpo que reconoce hemoglobina marcada con un primer marcador detectable como con (ii) ácido borónico o un derivado del mismo marcado con un segundo marcador detectable.

2. Un método para la determinación del porcentaje de glucohemoglobina en una muestra que comprende

(a) detectar:

(i) un primer marcador detectable acoplado con un primer agente que se une a la hemoglobina en dicha muestra; y

(ii) un segundo marcador detectable acoplado con un segundo agente que se une solo a la glucohemoglobina en dicha muestra; y

(b) determinar el porcentaje de glucohemoglobina en dicha muestra basándose en la cantidad del primer marcador detectable y el segundo marcador detectable detectada en dicha muestra.

3. El método de la reivindicación 2, en el que:

se pone en contacto la hemoglobina liberada de células de la muestra con el primer agente que está marcado con el primer marcador detectable y con el segundo agente que está marcado con el segundo marcador detectable;

estando inmovilizada la hemoglobina marcada detectablemente sobre un soporte sólido;

y en el que se obtienen la cantidad del primer marcador detectable y el segundo marcador detectable midiendo las señales del primer marcador detectable y del segundo marcador detectable inmovilizado sobre el soporte sólido.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3, en el que se detectan simultáneamente el primer marcador detectable y el segundo marcador detectable.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2-4, en el que el primer marcador detectable es un primer fluoróforo que muestra fluorescencia tras exposición a luz de una primera longitud de onda y el segundo marcador detectable es un segundo fluoróforo que muestra fluorescencia tras exposición a luz de una segunda longitud de onda, en el que la primera longitud de onda es diferente de la segunda longitud de onda.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2-5, en el que el segundo agente es un ácido borónico

o derivado del mismo.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 3-6, en el que (i) se pone en contacto la hemoglobina con el primer agente marcado con el primer marcador detectable y con el segundo agente marcado con el segundo marcador detectable antes de inmovilizar la hemoglobina sobre el soporte sólido; o (ii) se añade la hemoglobina al soporte sólido, comprendiendo el soporte sólido una región que comprende el primer agente marcado con el primer marcador detectable y el segundo agente marcado con el segundo marcador detectable, y en el que se pone en contacto la hemoglobina con el primer agente marcado y con el segundo agente marcado presentes sobre el soporte sólido antes de inmovilizar.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 3-7, en el que se detectan el primer agente y el segundo agente en aproximadamente la misma región del soporte sólido.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 3-8, en el que se miden las señales del primer marcador detectable y el segundo marcador detectable aplicando luz de una primera fuente de luz y una segunda fuente de luz a la hemoglobina inmovilizada sobre el soporte sólido, en el que la primera fuente de luz o la segunda fuente de luz comprenden opcionalmente un láser, y en el que la primera fuente de luz comprende opcionalmente un primer láser y la segunda fuente de luz comprende opcionalmente un segundo láser que es diferente del primer láser.

10. El método de la reivindicación 3, en el que:

el primer marcador detectable es un primer fluoróforo que muestra fluorescencia tras exposición a luz de una primera longitud de onda y el segundo marcador detectable es un segundo fluoróforo que muestra fluorescencia tras exposición a luz de una segunda longitud de onda;

en el que la hemoglobina marcada detectablemente, incluyendo la glucohemoglobina marcada detectablemente, se inmoviliza en la misma región sobre un soporte sólido;

y en el que se miden simultáneamente las señales del primer marcador detectable y del segundo marcador detectable inmovilizado sobre el soporte sólido exponiendo la región del soporte sólido en que se inmoviliza la hemoglobina, incluyendo glucohemoglobina, a luz de la primera y segunda longitudes de onda.

11. El método de la reivindicación 10, en el que el primer y segundo agentes se exponen a luz roja e infrarroja, respectivamente, o a luz infrarroja y roja respectivamente, para inducir la fluorescencia del primer y segundo marcadores detectables.

12. Una tira reactiva que comprende:

una tira cromatográfica;

un recubrimiento sobre una porción de la tira cromatográfica, comprendiendo el recubrimiento un agente de captura 10 que se une a la hemoglobina en una muestra;

una región en la tira cromatográfica en que se añade la muestra y una región sobre la tira cromatográfica que comprende un primer agente que se une a hemoglobina y un segundo agente que se une solo a glucohemoglobina, en la que el primer agente está marcado con un primer marcador detectable y el segundo agente está marcado con un segundo marcador detectable;

en la que la región en la tira cromatográfica que comprende el primer agente y el segundo agente está localizada (i) en la región en que se añade la muestra o (ii) entre la región en que se añade la muestra y la región que comprende el agente de captura, de tal modo que la muestra que se añade a la tira reactiva fluya a través de la región que comprende el primer y segundo agentes antes de alcanzar la región que comprende el agente de captura.

13. La tira reactiva de la reivindicación 12, en la que el primer marcador detectable es un fluoróforo que muestra fluorescencia tras exposición a luz de una primera longitud de onda y el segundo marcador detectable es un fluoróforo que muestra fluorescencia tras exposición a luz de una segunda longitud de onda que es diferente de la primera longitud de onda; y en la que la luz de la primera y segunda longitudes de onda es luz roja e infrarroja respectivamente, o infrarroja y roja respectivamente.

14. La tira reactiva de la reivindicación 12 o 13, en la que el segundo agente es un ácido borónico o derivado 25 del mismo.