Dendrímeros basados en PAMAM derivatizado con grupos alquil sulfonilo.

La presente invención describe unos compuestos derivados de vinilsulfonas que comprenden un núcleo de PAMAM derivatizado con grupos alquilsulfonilo y el procedimiento de obtención de los mismos. Estos compuestos forman complejos con fragmentos de ADN que son útiles para la transfección de células, por lo que la presente invención también describe el uso de estos compuestos como agentes de transfección

Dendrímeros basados en PAMAM derivatizado con grupos alquil sulfonilo.

La presente invención describe unos compuestos derivados de vinilsulfonas que comprenden un núcleo de PAMAM derivatizado con grupos alquilsulfonilo, así como el procedimiento de obtención de estos compuestos y su uso como agentes de transfección.

Estado de la técnica anterior

La supuesta capacidad de la terapia génica para el tratamiento de enfermedades genéticas ha conducido a una gran actividad investigadora sobre el diseño de vectores para la administración de genes que sean capaces de compactar y proteger oligonucleótidos como DNA contra la degradación por DNasas presentes en el suero. Los vectores no virales constituyen una alternativa atractiva al uso de virus, retrovirus y adenovirus, ya que resuelven problemas de los sistemas virales como la toxicidad, inmunogenicidad y los problemas de obtención a gran escala de estos sistemas virales. No obstante, los sistemas basados en virus tienen una elevada eficiencia de transfección. Aunque los sistemas no virales tienen per se una menor eficiencia de transfección (debido a las barreras intra y extracelulares que encuentran para una captación celular), estos vectores no virales pueden ser fácilmente modificados en su estructura de una manera sistemática para permitir el análisis de aquellos factores implicados en la modulación de su eficiencia.

El diseño de compuestos de naturaleza catiónica, como lípidos, polímeros, dendrímeros y péptidos que interaccionen de manera fuerte y no covalentemente con el esqueleto cargado negativamente del DNA se ha demostrado como una estrategia útil para el desarrollo de eficientes agentes sintéticos de transfección. Así, dendrímeros altamente ramificados han demostrado un alto potencial como vectores para la administración de genes comparados con sistemas poliméricos clásicos, debido a sus propiedades exclusivas: una superficie multivalente funcionalizable, una arquitectura tridimensional bien definida, así como tamaños y pesos moleculares adecuados (O. Rolland, C. O. Turrin, A. M. Caminade and J. P. Majoral, New J. Chem., 2009, 33, 1809). En concreto, los dendrímeros basados en poli(amidoamina) (PAMAM) que contienen grupos amino terminales fácilmente protonables y grupos amino terciarios internos son una herramienta de laboratorio frecuente debido a su sencilla síntesis química y su disponibilidad (P. P. Kundu and V. Sharma, Curr. Opin. Solid State Mater. Sci., 2008, 12, 89 M. Labieniec and C. Watala, Cent. Eur. J. Biol., 2009, 4, 434). Los complejos PAMAM-DNA, denominados dendriplexos y constituidos por la interacción entre grupos amino primarios (D. Shcharbin, E. Pedziwiatr, J. Blasiak and M. Bryszewska, J. Control. Release, 2010, 141, 110), constituyen sistemas supramoleculares cargados positivamente que tienen la capacidad de interaccionar con la membrana plasmática celular cargada negativamente, permitiendo la entrada a la célula a través de un sistema endosomal, sin producir ni citotoxicidad ni inmunogenicidad de manera significativa. Una vez internalizados, la capacidad tampón de los grupos amino no protonados va a permitir que actúen como una esponja de protones en el entorno ácido de los endosomas, facilitando de esta manera la liberación del DNA desde el dendriplexo al citoplasma celular gracias a la inhibición de las nucleases endosomales dependientes de pH.

La influencia de la generación del dendrímero en la eficiencia de transfección (también llamado efecto dendrítico) fue identificada hace tiempo y así, los dendrímeros de tamaño medios (G5-G10) son considerados como los más eficientes. Por otro lado, para incrementar el rendimiento de transfección de los PAMAMs se han desarrollado tres estrategias: a) incrementar la flexibilidad de las ramas, b) transformar el dendrímero en ambifílico y c) hacerlo biocompatible. La degradación térmica de PAMAMs de alta generación origina vectores "fracturados" con una alta flexibilidad y que son comerciales (Superfect). Además, la modificación de la superficie mediante la funcionalización de la periferia del PAMAM se ha investigado extensamente para tratar de mejorar no solo la formación de complejos con el DNA, interacción con la membrana plasmática y liberación de los endosomas, sino también de reducir la citotoxicidad y tratar de incorporar grupos funcionales que produzca el direccionamiento de los dendriplexos a un tipo celular específico (K. Jain, P. Kesharwani, U. Gupta and N. K. Jain, Int. J. Pharm., 2010, 394, 122). La conjugación de los grupos amino primarios con polietilenglicol, aminoácidos, péptidos, proteínas, azúcares, ciclodextrinas, lípidos y glucocorticoides se ha descrito y ha tenido unos resultados variables en cuanto a la eficiencia de transfección. Numerosos trabajos han demostrado las ventajas de incorporar motivos lipofílicos a los dendrímeros para transformarlos en moléculas ambifílicas capaces de producir una transfección aumentada. Así, PAMAMs modificados con lípidos se han construido con topologías en las que la porción hidrofílica dendrítica se localizaba en una parte de la molécula mientras que la porción hidrofóbica, fundamentalmente cadenas alquílicas de longitud variable, se localizaban en la parte opuesta de la molécula (T. Takahashi, C. Kojima, A. Harada and K. Kono, Bioconjug. Chem., 2007, 18, 1349). De forma alternativa, dendrímeros de PAMAM con un interior hidrofílico y una corona hidrofóbica se han obtenido uniendo al azar colas alquílicas en la periferia (J. L. Santos, H. Oliveira, D. Pandita, J. Rodrigues, A. P. Pêgo, P. L. Granja and H. Tomás, J. Controlled Release, 2010, 144, 55.). En ambos casos, la influencia de parámetros como la generación dendrítica, la longitud de la cadena alquílica y el grado de funcionalización en la eficiencia de transfección y citotoxicidad se han evaluado. La adición de Michael de derivados de acrilato así como la acilación con esteres activados de ácidos grasos han sido las herramientas sintéticas utilizadas para la fabricación de este tipo de vectores

Descripción de la invención

La presente invención describe una serie de compuestos ambifílicos derivados de PAMAM donde algunos grupos amino periféricos de estos dendrímeros se han unido a derivados de vinilsulfona conteniendo cadenas hidrofóbicas. Igualmente se describen las propiedades de transfección de los compuestos resultantes las cuales dependen de la naturaleza química de la cadena hidrofóbica y del grado de extensión de la modificación de superficie de los dendrímeros. Algunos de los dendrímeros derivados PAMAM demuestran ser vectores útiles para la transfección y poseen mejores propiedades que el PAMAM sin modificar o reactivos comerciales de transfección como la LipofectaMINA 2000: a) una mayor eficiencia de transfección, b) una menor citotoxicidad, c) la capacidad de mantener la transfección en presencia de suero y d) la posibilidad de transfectar distintos tipos de líneas celulares. Igualmente se describe la preparación de sondas fluorescentes para monitorizar las rutas de endocitosis útiles en la transfección mediada por estos dendrímeros y obtener información de los mecanismos de internalización empleados por estos vectores.

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula general (I):

donde

G representa un dendrímero aminado que se selecciona de entre PAMAM, polietileniminas, polilisinas o polipropilenimina,

R₁ se selecciona entre alquilo C₁-C₂₀, alquenilo C₂-C₂₀, o el grupo -Y-R₂

Y se selecciona entre O ó S,

R₂ se selecciona entre el grupo -CH₂-CH₂-NH-CO-R₃ o un esterol,

R₃ se selecciona entre alquilo C₁-C₂₀ o alquenilo C₂-C₂₀,

m es un valor entre 1 y 4,

n es un valor entre 1 y p, siendo p el número de grupos -NH₂ de superficie del dendrímero aminado.

El término "alquilo" se refiere, en la presente invención, a radicales de cadenas hidrocarbonadas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 20 átomos de carbono, preferiblemente de 2 a 18, y que se unen al resto de la molécula mediante un enlace sencillo, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, terc-butilo, sec-butilo,... [Seguir leyendo]

1. Compuesto de fórmula general (I):

donde

G representa un dendrímero aminado que se selecciona de entre PAMAM, polietileniminas, polilisinas o polipropilenimina,

R₁ se selecciona entre alquilo C₁-C₂₀, alquenilo C₂-C₂₀, o el grupo -Y-R₂

Y se selecciona entre O ó S,

R₂ se selecciona entre el grupo -CH₂-CH₂-NH-CO-R₃ o un esterol,

R₃ se selecciona entre alquilo C₁-C₂₀ o alquenilo C₂-C₂₀,

m es un valor entre 1 y 4,

n es un valor entre 1 y p, siendo p el número de grupos -NH₂ de superficie del dendrímero aminado.

2. Compuesto según la reivindicación 1 donde el dendrímero aminado es un PAMAM de segunda generación, siendo p=16.

3. Compuesto según la reivindicación 2 donde m es 1.

4. Compuesto según la reivindicación 3 donde R₁ es un alquilo C₁-C₁₈.

5. Compuesto según la reivindicación 4 donde R₁ se selecciona entre -(CH₂)₂CH₃, -(CH₂)₁₀CH₃ o -(CH₂)₁₆CH₃.

6. Compuesto según la reivindicación 2 donde R₁ es un alquenilo C₁-C₁₈.

7. Compuesto según la reivindicación 6 donde R₁ es (CH₂)₇CH=CH(CH₂)₇CH₃.

8. Compuesto según la reivindicación 2 donde m es 2.

9. Compuesto según la reivindicación 8 donde R₁ es el grupo -O-R₂.

10. Compuesto según la reivindicación 8 donde R₁ es el grupo -S-R₂.

11. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10 donde R₂ es -CH₂-CH₂-NH-CO-R₃, siendo R₃ un alquilo C₁-C₁₈.

12. Compuesto según la reivindicación 11 donde R₃ se selecciona entre -(CH₂)₂CH₃, -(CH₂)₁₀CH₃ o -(CH₂)₁₆CH₃.

13. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10 donde R₂ es -CH₂-CH₂-NH-CO-R₃, siendo R₃ un alquenilo C₁-C₁₈.

14. Compuesto según la reivindicación 13 donde R₃ es (CH₂)₇CH=CH(CH₂)₇CH₃.

15. Compuesto según la reivindicación 9 donde R₂ es un esterol que se selecciona de la lista que comprende colesterol, epicolesterol estigmasterol, lanosterol, ergosterol y coprostenol.

16. Compuesto según la reivindicación 15 donde R₂ es colesterol.

17. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde n es un valor que se selecciona entre 2 ó 1.

18. Compuesto de fórmula general (II):

donde

G representa un dendrímero aminado que se selecciona de entre PAMAM, polietileniminas, polilisinas o polipropilenimina,

R₁ se selecciona entre alquilo C₁-C₂₀, alquenilo C₂-C₂₀, o el grupo -Y-R₂

Y se selecciona entre O ó S,

R₂ se selecciona entre el grupo -CH₂-CH₂-NH-CO-R₃ o un esterol,

R₃ se selecciona entre alquilo C₁-C₂₀ o alquenilo C₂-C₂₀,

R₄ es un grupo fluorogénico,

m es un valor entre 1 y 4,

n es un valor entre 1 y p, siendo p el número de grupos -NH₂ de superficie del dendrímero aminado,

q es un valor que se selecciona entre 1 y 2.

19. Compuesto según la reivindicación 18 donde q es 1.

20. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 19 ó 20 donde R₄ es rodamina o un derivado de la misma.

21.Complejo que comprende un compuesto de fórmula (I) o un compuesto de fórmula (II) y un fragmento de ADN.

22. Uso del complejo según la reivindicación 21 para la fabricación de una composición farmacéutica.

23. Composición que comprende un compuesto de fórmula (I), un compuesto de fórmula (II), un complejo según la reivindicación 21 o cualquiera de sus combinaciones, caracterizada porque la relación estequiométrica entre G y los grupos sulfonados tiene un valor entre 0,5 y 2.

24. Composición según la reivindicación 23 donde la relación estequiométrica G:grupos sulfonados es 0,5.

25. Uso de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 23 ó 24 como agente de transfección génica.

26. Procedimiento de obtención de un compuesto de fórmula (I) que comprende una reacción de adición de Michael del compuesto de fórmula (III):

donde:

m y R₁ se definen como en la reivindicación 1, a un dendrímero aminado que se selecciona de entre PAMAM, polietileniminas, polilisinas o polipropilenimina.

27. Procedimiento según la reivindicación 26 donde el dendrímero aminado es un dendrímero PAMAM de segunda a sexta generación.

28. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 26 ó 27 donde la reacción se produce en un medio tetrahidrofurano/agua.