Un polipéptido de neublastina que es al menos un 80% idéntico a los aminoácidos 8-113 de la SEC ID Nº 1 y que contiene una sustitución de una o más de la arginina de la posición 48,

la arginina de la posición 49, o la arginina de la posición 51 con un resto de ácido glutámico

Conjugados poliméricos de neublastina mutada.

Campo de la invención

La invención se refiere a química proteica, biología molecular, neurobiología, neurología, y tratamiento del dolor.

Antecedentes de la invención

Los factores neurotróficos son proteínas de origen natural que regulan la supervivencia neuronal durante el desarrollo y regulan la plasticidad e integridad estructural del sistema nervioso adulto. Los factores neurotróficos pueden aislarse de tejido neural y de tejido no neural. Durante los últimos veinte años, se han descubierto muchos factores neurotróficos. Estos factores neurotróficos pueden clasificarse en superfamilias, familias, subfamilias y especies individuales en base a su estructura y función.

Las superfamilias de factores neurotróficos incluyen la superfamilia de factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), la superfamilia de neutrofina, y la superfamilia del factor de crecimiento transformante-β (TGF-β). Los ligandos relacionados con el factor neurotrópico derivado de la línea celular glial (GDNF) son una familia de proteínas dentro de la superfamilia TGF-β. Los ligandos relacionados con GENF incluyen GDNF, persefina (PSP), neurturina (NTN) y neublastina (NBN; conocida como artemina o enovina). Los miembros de la familia de ligandos relacionados con GENF se distinguen por, entre otras cosas, sus siete restos de cisteína conservados. Estos restos forman puentes disulfuro intramoleculares e intermoleculares y dan lugar a la estructura terciaria y cuaternaria del ligando polipeptídico dimerizado. Los miembros de la familia también comparten la capacidad de inducir la señalización a través de un complejo receptor de múltiples componentes que consta de un co-receptor anclado a glucosilfosfatidilinositol (GPI) de la familia GFRα, un miembro de la subfamilia de ligandos relacionados con GDNF, y el receptor tirosina quinasa RET.

RET activado inicia una cascada de transducción de señales que es responsable, al menos en parte, de los efectos corriente abajo de los ligandos relacionados con GDNF. Por consiguiente, la activación de RET puede representar un aspecto deseable de una terapia que actúe a través de una vía del receptor GFRα para afectar a los procesos celulares corriente abajo.

La neublastina está clasificada dentro de la familia GDNF porque comparte regiones de homología con otros ligandos GDNF incluyendo el motivo de siete cisteínas (por ejemplo, como se describe en el documento EP02/02691, las publicaciones PCT US02/02319 y US02/06388), y a causa de su capacidad de unirse a, y activar, el receptor RET como parte de un complejo GFRα. Específicamente, la neublastina es muy selectiva para la unión al complejo receptor GFRα3-RET. A este respecto, la neublastina contiene sub-regiones únicas en su secuencia de aminoácidos en comparación con otros miembros de la familia de ligandos relacionados con GDNF.

Los datos actuales sugieren que la neublastina puede tener un papel protector y regenerador en los sistemas nervioso periférico y central y, como resultado, puede ser útil como agente terapéutico para trastornos neurodegenerativos. Por ejemplo, los datos sugieren que la neublastina puede tener efectos promotores de la supervivencia sobre neuronas sensoriales cultivadas a partir de ganglios de la raíz dorsal y de los ganglios trigeminales, y sobre neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra cultivadas (Baloh et al., Neuron 21: 1291-1302 (1998)). Por lo tanto parece que la neublastina puede promover la supervivencia de poblaciones neuronales incluyendo neuronas sensoriales y dopaminérgicas. Esto es importante porque la degeneración y disfunción de las neuronas está asociada con patologías. Por ejemplo, patologías de neuronas sensoriales y dopaminérgicas subyacen a neuropatía periférica y enfermedad de Parkinson, respectivamente.

Por lo tanto, la administración de neublastina puede ser útil, por ejemplo, en el tratamiento de enfermedades asociadas con degeneración y disfunción neuronal. Sin embargo, la neublastina se elimina rápidamente del cuerpo, lo que puede afectar al paradigma de dosificación de neublastina necesaria en aplicaciones terapéuticas. Por tanto, existe la necesidad de polipéptidos de neublastina mutada con biodisponibilidad potenciada. Por consiguiente, un objeto de la presente invención es identificar formas mutadas de neublastina que muestren biodisponibilidad potenciada.

Sumario de la invención

La invención proporciona un polipéptido de neublastina que es al menos un 80% idéntico a los aminoácidos 8-113 de la SEC ID Nº 1 y que contiene una sustitución de una o más de la arginina en la posición 48, la arginina en la posición 49, o la arginina en la posición 51 con un resto de ácido glutámico. La invención también proporciona el polipéptido, en el que el resto de arginina en la posición 48 está sustituido con ácido glutámico. Como alternativa, se proporciona el polipéptido en el que el resto de arginina en la posición 49 esta sustituido con ácido glutámico. También se proporciona el polipéptido, en el que el resto de arginina en la posición 51 está sustituido con ácido glutámico.

También se describen dímeros de neublastina mutada conjugada con polímero. Cada dímero contiene un primer polipéptido que comprende un primer aminoácido amino-terminal y un segundo polipéptido que comprende un segundo aminoácido amino-terminal. Cada polipéptido contiene individualmente: (a) una secuencia de aminoácidos caracterizada por una identidad de secuencia de al menos el 70%, 80%, 90%, o 95% con los aminoácidos 8-113 de la SEC ID Nº 1; (b) un resto de cisteína en cada una de las posiciones 16, 43, 47, 80, 81, 109, y 111 (numeración de acuerdo con la SEC ID Nº 1); (c) los siguientes restos aminoacídicos: C en la posición 16, L en la posición 18, V en la posición 25, L en la posición 28, G en la posición 29, L en la posición 30, G en la posición 31, E en la posición 36, F en la posición 40, R en la posición 41, F en la posición 42, C en la posición 43, G en la posición 45, C en la posición 47, C en la posición 80, C en la posición 81, R en la posición 82, P en la posición 83, F en la posición 91, D en la posición 93, S en la posición 105, A en la posición 106, C en la posición 109 y C en la posición 111; y (d) una repetición LGLG, un motivo FRFC, un motivo QPCCRP, y un motivo SATACGC. El dímero incluye al menos una sustitución aminoacídica (con respecto a la SEC ID Nº 1), que proporciona un sitio interno de conjugación con polímero en el que se conjuga un polímero.

En este documento también se describe un dímero de neublastina mutada conjugada con polímero que contiene un primer polipéptido y un segundo polipéptido, en el que cada polipéptido contiene los aminoácidos 90-140, por ejemplo, 95-120 ó 100-110, de la SEC ID Nº 6 con 1-6 sustituciones aminoacídicas, proporcionando cada sustitución un sitio de conjugación con polímero en el que se conjuga un polímero. Los ejemplos de polipéptidos descritos en este documento incluyen NBN113 (SEC ID Nº 2), NBN140 (SEC ID Nº 6), NBN116 (SEC ID Nº 7), NBN112 (SEC ID Nº 8), NBN111 (SEC ID Nº 9), NBN110 (SEC ID Nº 10), NBN109 (SEC ID Nº 11), NBN108 (SEC ID Nº 12), NBN107 (SEC ID Nº 13), NBN106 (SEC ID Nº 14), NBN105 (SEC ID Nº 15), NBN104 (SEC ID Nº 16), NBN103 (SEC ID Nº 17), NBN102 (SEC ID Nº 18), NBN101 (SEC ID Nº 19), NBN100 (SEC ID Nº 20) y NBN99 (SEC ID Nº 21).

Al menos uno de los dos aminoácidos amino-terminales en el dímero puede estar conjugado con un polímero. Las sustituciones de aminoácidos pueden incluir el remplazo de un resto de arginina con un resto de lisina (RnºaaK; donde nºaa es el número de aminoácido en base a la SEC ID Nº 1), y el remplazo de un resto de asparagina con un resto de lisina (NnºaaK) o un resto de aspartato (NnºaaD). Ejemplos específicos de dicha sustitución son R14K, R39K, R68K, N95D, y N95K (numeración basada en la SEC ID Nº 1). La sustitución puede ser N95K.

Como se describe en este documento, el peso molecular combinado total de los polímeros en un dímero puede ser de 20.000-40.000 Da. El peso molecular promedio de cada polímero puede ser de 2.000-100.000 Da; o de 5.000-50.000 Da o aproximadamente de 10.000 a 20.000 Da. El polímero puede ser lineal o ramificado. El polímero puede ser un resto de polialquilenglicol, por ejemplo, un resto de polietilenglicol (PEG). Al menos un polipéptido puede estar glucosilado.

Como se describe en este documento,...

1. Un polipéptido de neublastina que es al menos un 80% idéntico a los aminoácidos 8-113 de la SEC ID Nº 1 y que contiene una sustitución de una o más de la arginina de la posición 48, la arginina de la posición 49, o la arginina de la posición 51 con un resto de ácido glutámico.

2. El polipéptido de la reivindicación 1, en el que el resto de arginina de la posición 48 está sustituido con ácido glutámico.

3. El polipéptido de la reivindicación 1, en el que el resto de arginina de la posición 49 está sustituido con ácido glutámico.

4. El polipéptido de la reivindicación 1, en el que el resto de arginina de la posición 51 está sustituido con ácido glutámico.