COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA SUMINISTRAR ANTICUERPOS ANTI-RAS ACTIVADA EN CÉLULAS.

Un polipéptido quimérico que se caracteriza porque dicho polipéptido comprende un primer dominio y un segundo dominio,

en los que: - el primer dominio comprende una secuencia de aminoácidos que facilita el transporte activo a través de una membrana biológica mediante la unión a un glicosaminoglicano que se selecciona del grupo que consiste en a) (XBBBXXBX)n; b) (XBBXBX)n; c) (BBXmBBXp)n; d) (XBBXXBX)n; e) (BXmBB)n; f) (BmXX)n; o g) un fragmento de anticuerpo, en el que cada B es independientemente un aminoácido básico, preferiblemente lisina o arginina; cada X es independientemente un aminoácido no básico, preferiblemente un aminoácido hidrófobo; cada m es independientemente un número entero de cero a cinco; cada n es independientemente un número entero entre uno y diez; y cada p es independientemente un número entero entre cero y cinco; y - el segundo dominio comprende un anticuerpo neutralizante anti-RAS activada, su fragmento o su derivado, que se une de modo específico a un epitopo sobre la proteína RAS activada

Composiciones y métodos para suministrar anticuerpos anti-RAS activada en células.

Esta invención se refiere, en general, a composiciones y métodos para tratar enfermedades proliferativas, tales como cánceres y, más en concreto, a composiciones que comprenden un anticuerpo conjugado con un péptido que penetra en células.

Las proteínas RAS son proteínas G prototípicas que han demostrado desempeñar un papel clave en la transducción de señales, la proliferación y la transformación maligna. La proteína RAS-21 activada (oncogénica) se ha implicado, como factor causativo principal, en una alta proporción de tumores sólidos humanos. Se han detectado genes ras mutados en un gran número de cánceres, que comprenden el adenocarcinoma de páncreas (90%), de colon (50%) y de pulmón (30%). La inhibición de la expresión del oncogén Ki-ras en líneas celulares tumorales humanas provoca la regresión completa en modelos animales ((Shirasawa et al., Science, 260, 85-88 (1993)). Por consiguiente, la vía de RAS es una diana atractiva para estrategias terapéuticas (Downward, Nat. Rev. Cancer., 3(1), 11-22 (2003)).

Los anticuerpos son extremadamente específicos, a veces mucho más específicos que los fármacos de molécula pequeña, y no son inherentemente tóxicos. El análisis de unión a antígenos puede presentar afinidades (K_D) cercanas al registro nanomolar bajo, según se mide mediante una ELISA de unión. Esta especificidad hace que la tecnología de anticuerpos monoclonales sea valiosa para usos terapéuticos. El anticuerpo monoclonal de rata neutralizante Y13259 (IgG1) (ATCC nº CRL-1742), que reconoce las cuatro proteínas RAS-p21 de mamífero mutadas (H, N, K-4A y K-4B), dificulta enormemente la reacción de intercambio de nucleótidos entre los nucleótidos de guanina unidos a p21 y exógenos (Furth et al., J. Virol., 43, 294-304 (1982); Hattori et al., Mol. Cell. Biol., 7, 1999-2002 (1987)), y ha demostrado que puede revertir el fenotipo de células NIH 3T3 transformadas con el gen oncogénico ras después de una microinyección, o produce la regresión de tumores en ratones atímicos utilizando scFc anti-RAS y un vector adenovírico (Cochet et al., Cancer Res. 58, 1170-1176 (1998); Kung et al., Exp. Cell Res., 162, 363-371 (1986)).

Aunque la proteína RAS-p21 representa una diana terapéutica validada en oncología, las estrategias de anticuerpos terapéuticos no son posibles porque la proteína RAS-p21, al igual que muchas dianas terapéuticas, es una proteína intracelular, y porque los anticuerpos son incapaces de atravesar las membranas celulares o nucleares para interaccionar con sus antígenos intracelulares. Por tanto, un objetivo principal de la invención es proporcionar anticuerpos más eficaces y composiciones farmacéuticas para el tratamiento del cáncer.

La solicitud de patente PCT nº WO 04/041688 describe moléculas inmunológicas capaces de unirse de modo específico a una proteína RAS activada dentro de un entorno intracelular, en las que el anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera. También indica que estas inmunoglobulinas pueden condensarse o conjugarse con un dominio o una secuencia procedente de una proteína responsable de la actividad de translocación (mediante esta forma, la inmunoglobulina es capaz de entrar en la célula o en su núcleo cuando se introduce en la vecindad de la célula), tales como los dominios y las secuencias de la proteína transactivante de VIH-1 (Tat), la proteína del homeodominio de Antennapedia de Drosophila, y la proteína VP22 del virus del herpes simplex-1. Para el transporte de anticuerpos a células también se utiliza el péptido TLM (Oess y Hildt, Gene Ther., 7, 750-758, (2000)), o una tecnología de anticuerpos anti-ADN. El uso de un anticuepo con un único dominio puede tener ciertas limitaciones, incluyendo la estabilidad en sangre durante los estudios in vivo o una baja especificidad de antígeno. Esto demuestra la importancia de un sistema de transporte óptimo que pueda proteger al anticuerpo y mejorar su biodistribución. Los péptidos de transporte indicados se originan de proteínas víricas (Tat, VP22, TLM) o de secuencias no humanas (Antennapedia), y pueden ser tóxicos e inmunogénicos en seres humanos.

Dentro del marco de investigación que ha conducido a esta invención, el solicitante ha conjugado el anticuerpo monoclonal de rata Y13259 (ATCC nº CRL-1742) a ciertos péptidos que penetran en células (CPP) para permitir su translocación hacia el interior de las células.

Esta invención tiene como objetivo, específicamente, un anticuerpo neutralizante anti-RAS activada conjugado con al menos un péptido que penetra en células (CPP) para mediar una actividad antiproliferativa. El solicitante ha demostrado que la unión de péptidos que penetran en células a anticuerpos monoclonales potencia su eficacia contra células de cáncer.

Según otra realización, el conjugado de anticuerpo neutralizante anti-RAS activada-CPP seleccionado de la presente invención puede utilizarse como composiciones administradas por separado o en combinación con otros fármacos, tales como fármacos citotóxicos, citostáticos o inmunoterapéuticos, y más en concreto, ciclosporina, metotrexato, adriamicina, cisplatino o taxoides (placlitaxel, doxorrubicina, etc.).

La invención proporciona además un método para el tratamiento o la prevención de cánceres o adenocarcinomas en un sujeto, que comprende la administración al sujeto, en una cantidad eficaz para dicho tratamiento o prevención, de un conjugado de anticuerpo neutralizante anti-RAS activada-péptido que penetra en células de la invención. El conjugado de anticuerpo-CPP utilizado para el tratamiento puede estar en forma de una composición, preferiblemente una composición farmacéutica, que comprende dicho conjugado y un vehículo farmacéuticamente aceptable. De manera ventajosa, el anticuerpo es capaz de unirse de modo selectivo a la proteínas RAS activada intracelular in vitro y/o in vivo y, por consiguiente, la proteína RAS activada se inactiva funcionalmente.

Por tanto, la presente invención se refiere a un polipéptido quimérico, que se caracteriza porque dicho polipéptido comprende un primer dominio y un segundo dominio, en el que:

- el primer dominio comprende una secuencia de aminoácidos que facilita el transporte activo a través de una membrana biológica mediante la unión a un glicosaminoglicano que se selecciona del grupo que consiste en a) (XBBBXXBX)n; b) (XBBXBX)n; c) (BBXmBBXp)n; d) (XBBXXBX)n; e) (BXmBB)n; f) (BmXX)n; o g) un fragmento de anticuerpo, en el que cada B es independientemente un aminoácido básico, preferiblemente lisina o arginina; cada X es independientemente un aminoácido no básico, preferiblemente un aminoácido hidrófobo; cada m es independientemente un número entero de cero a cinco; cada n es independientemente un número entero entre uno y diez; y cada p es independientemente un número entero entre cero y cinco; y

- el segundo dominio comprende un anticuerpo neutralizante anti-RAS activada, su fragmento o su derivado.

Los términos "péptido" y "péptidos" se refieren a un polímero de aminoácidos para los cuales la convención escrita es N o amino terminal a la izquierda, y C o carboxilo terminal a la derecha. Los 20 L-aminoácidos naturales más comunes se denominan, de forma alternativa, mediante un código de tres letras o de una letra. Se considera que los péptidos, tal como se emplean en la presente, incluyen los "análogos de péptidos", modificaciones estructurales que contienen una o más modificaciones de las cadenas laterales de los L-aminoácidos o del esqueleto de alfa-aminoácidos. Un ejemplo de un análogo de péptido con esqueleto modificado es el "peptoide" de N-metilglicina (Zuckermann et al., J. Amer. Chem. Soc., 114: 10646-10647 (1992)).

Las expresiones "péptido que penetra en células" o "péptidos que penetran en células" (CPP) se definen como un péptido vehículo que es capaz de atravesar una membrana biológica o una membrana fisiológica. Los péptidos que penetran en células también se denominan péptidos permeables a células, dominios de transducción de proteínas (PTD) o secuencias de translocación de membrana (MTS). Los CPP tienen la capacidad de translocar in vitro y/o in vivo las membranas de células de mamífero y entrar en las células, y dirigen un compuesto conjugado de interés, tal como...

1. Un polipéptido quimérico que se caracteriza porque dicho polipéptido comprende un primer dominio y un segundo dominio, en los que:

- el primer dominio comprende una secuencia de aminoácidos que facilita el transporte activo a través de una membrana biológica mediante la unión a un glicosaminoglicano que se selecciona del grupo que consiste en a) (XBBBXXBX)n; b) (XBBXBX)n; c) (BBXmBBXp)n; d) (XBBXXBX)n; e) (BXmBB)n; f) (BmXX)n; o g) un fragmento de anticuerpo, en el que cada B es independientemente un aminoácido básico, preferiblemente lisina o arginina; cada X es independientemente un aminoácido no básico, preferiblemente un aminoácido hidrófobo; cada m es independientemente un número entero de cero a cinco; cada n es independientemente un número entero entre uno y diez; y cada p es independientemente un número entero entre cero y cinco; y

- el segundo dominio comprende un anticuerpo neutralizante anti-RAS activada, su fragmento o su derivado, que se une de modo específico a un epitopo sobre la proteína RAS activada.

2. El polipéptido quimérico según la reivindicación 1, en el que el primer dominio comprende una secuencia de aminoácidos que facilita el transporte activo a través de una membrana biológica, que tiene una longitud de más de 4 aminoácidos, preferiblemente más de 6 aminoácidos, y lo más preferiblemente más de 13 aminoácidos.

3. El polipéptido quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el primer dominio comprende una secuencia de aminoácidos que facilita el transporte activo a través de una membrana biológica, que tiene una longitud menor que 500 aminoácidos, preferiblemente menor que 35 aminoácidos, y lo más preferiblemente menor que 25 aminoácidos.

4. El polipéptido quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que cada X es independientemente alanina, ácido glutámico, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, serina, triptófano, valina, tirosina o citrulina.

5. El polipéptido quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el primer dominio comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que comprende SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12.

6. El polipéptido quimérico según la reivindicación 1, en el que el primer dominio comprende la secuencia de aminoácidos (BmXX)n, en la que B es cualquier aminoácido básico, X es cualquier aminoácido no básico, cada m es independientemente un número entero entre 1 y 10, y cada n es independientemente un número entero entre 1 y 4.

7. El polipéptido quimérico según la reivindicación 6, en el que el primer dominio comprende la secuencia de aminoácidos BBBBBBXXBBBBBBXX, en la que B es independientemente un aminoácido básico, y X es independientemente un aminoácido no básico.

8. El polipéptido quimérico según la reivindicación 7, en el que X se selecciona del grupo que comprende ácido glutámico y serina.

9. El polipéptido quimérico según la reivindicación 8, en el que el primer dominio comprende SEQ ID NO:2.

10. El polipéptido quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo neutralizante anti-RAS activada, su fragmento o su derivado tienen la capacidad de unirse a una proteína RAS activada, dando como resultado la inhibición de la actividad biológica de dicha proteína RAS activada.

11. El polipéptido quimérico según la reivindicación 10, en el que el anticuerpo neutralizante anti-RAS activada, su fragmento o su derivado se selecciona del grupo que comprende un anticuerpo monoclonal de rata Y13259 (producido mediante el clon de hibridoma originado de ATCC, nº CRL-1742), sus fragmentos y sus derivados.

12. El polipéptido quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la proteína RAS activada se selecciona del grupo que comprende H-RAS, N-RAS, K-RAS A y K-RAS B.

13. El polipéptido quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo neutralizante anti-RAS activada, su fragmento o su derivado se conjuga en el N- o C-terminal del primer dominio.

14. El polipéptido quimérico según la reivindicación 13, en el que el anticuerpo neutralizante anti-RAS activada, su fragmento o su derivado se conjuga con el primer dominio a través de un conector.

15. El polipéptido quimérico según la reivindicación 14, en el que el conector es 4-(N-maleimidometil)ciclohexan-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC) o N-maleimidobutilamina.

16. El polipéptido quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14, en el que ambos dominios se condensan mediante modificación genética.

17. Un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido según la reivindicación 16.

18. Una composición que comprende un polipéptido quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, o un polinucleótido según la reivindicación 17, y opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.

19. Un uso de un polipéptido quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, o un polinucleótido según la reivindicación 17, para la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer.