Secuencias de aminoácidos que facilitan la penetración de una sustancia de interés dentro de las células y/o los núcleos celulares.

Una secuencia de aminoácidos que es capaz de facilitar la penetración de una sustancia de interés dentro de los núcleos celulares,

dicha sustancia de interés se selecciona del grupo que comprende ácido nucleico, proteína, fármaco, antígeno, anticuerpo, polímero, marcador tal como fluorocromo, y dicha secuencia de aminoácidos tiene la siguiente fórmula:

(X1) p X B B B X B X X B X B B B X B XX B (III)

En donde X1 es una secuencia de aminoácidos de 1 a 20 aminoácidos;

p es un número completo entre 0 y 5;

B es un aminoácido básico;

X es un aminoácidos no básico, preferiblemente hidrófobo, tal como alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina o tirosina.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/IB2004/002936.

Solicitante: CELLECTIS.

Nacionalidad solicitante: Francia.

Dirección: 8, rue de la Croix Jarry 75013 Paris FRANCIA.

Inventor/es: AVRAMEAS,Alexandre.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K16/00 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales.

PDF original: ES-2378312_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Secuencias de aminoácidos que facilitan la penetración de una sustancia de interés dentro de las células y/o los núcleos celulares

Campo de la Invención La invención se relaciona con el campo de la composición para el suministro de la sustancia activa dentro de las células y/o núcleos celulares. Más particularmente la invención describe secuencias de aminoácidos que tienen la capacidad de facilitar la penetración de una sustancia de interés tal como un fármaco dentro de los núcleos celulares.

Antecedentes Subsiste a necesidad de una composición y método capaz de transferir la sustancias de interés desde el medio externo al interior de las células, y más específicamente los núcleos celulares. Tal composición y método son útiles para mejorar el suministro de fármacos dentro del citoplasma y/o los núcleos celulares del organismo anfitrión que se va a tratar. Una aplicación importante de tal composición y método se relaciona con el campo de terapia génica cuando son necesarios vectores no tóxicos y selectivos para introducir el ADN dentro de la célula y más específicamente los núcleos celulares.

Se han propuesto péptidos y secuencias de aminoácidos para transferir las sustancias de interés desde el medio externo hasta el interior de las células. Por ejemplo, la solicitud de patente PCT publicada bajo No. WO 01/64738, describe las secuencias de aminoácidos que reaccionan con aminoglicanos y transferencia de un amplio rango de las sustancia activas (biológicas, farmacéuticas, cosméticas, nutricionales, diagnósticas o de seguimiento) tal como ácidos nucleicos, proteínas, fármacos, antígenos o anticuerpos.

Resumen de la Invención

Se han encontrado ahora nuevas secuencias de aminoácidos que se pueden utilizar in vivo e in vitro como agentes para internalizar las sustancias de interés dentro de las células. Por lo tanto la presente invención se relaciona con una secuencia de aminoácidos que es capaz de facilitar la penetración de una sustancia de interés seleccionada del grupo que comprende ácido nucleico, proteína, fármaco, antígeno, anticuerpo, polímero y marcador tal como fluorocromo dentro de los núcleos celulares y tiene la siguiente fórmula:

(X1) p X B B B X B X X B X B B B X B XX B (III)

En donde X1 es una secuencia de aminoácidos de 1 a 20 aminoácidos;

p es un número completo entre 0 y 5;

B es un aminoácido básico;

X es un aminoácido no básico, preferiblemente hidrófobo, tal como alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina o tirosina.

De manera general, la secuencia de aminoácidos de la fórmula (III) que tiene menos de 100 aminoácidos, menos de 50 aminoácidos se considera mejor, y menos de 25 aminoácidos todavía mejor.

Ventajosamente, las secuencias de aminoácidos de acuerdo con la invención tienen entre 18 y 25 aminoácidos.

De manera general, la secuencia de aminoácidos incluye un alto número de aminoácidos básicos (B) tal como lisina, arginina o histidina.

"alto número" se debe entender como por lo menos igual a 3.

Las secuencias de aminoácidos preferidas de acuerdo con la invención son aquellas en donde:

- p es 0, y/o

- X1 es una secuencia de 2 a 5 aminoácidos, y/o

En otra realización, diversos o todos los L-aminoácidos de la secuencia de aminoácidos anterior se pueden cambiar a los Aminoácidos D. En cierta realización preferida, el aminoácido de terminal N y/o de terminal C es un Aminoácido D.

Particularmente una secuencia de aminoácidos de interés de acuerdo con la fórmula anterior son:

DPV15b: Gly Ala Tyr Asp Leu Arg Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg Leu Arg Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg (SEQ ID NO.2) .

La presente invención se relaciona adicionalmente con las siguientes secuencias de aminoácidos que se pueden utilizar in vivo e in vitro como agentes para internalizar las sustancias de interés dentro de las células:

DPV3: NH2-R K K R R R E S R K K R R R E S-COOH

DPV3/10: NH2-R K K R R R E S R R A R R S P R H L-COOH

DPV6: NH2-G R P R E S G K K R K R K R L K P-COOH

DPV7: NH2-G K R K K K G K L G K K R D P-COOH

DPV7b NH2-G K R K K K G K L G K K R P R S R-COOH

DPV10: NH2-S R R A R R S P R H L G S G-COOH

DPV10/6: NH2-S R R A R R S P R E S G K K R K R K R-COOH

Respectivamente la SEQ ID No 4, 5, 6, 8, 9, 3, 7.

La invención se relaciona con estas secuencias con o sin las Cisteínas del terminal C. Se puede agregar cisteína en la posición del terminal C o N de las secuencias para conjugar los péptidos con las moléculas.

Por lo tanto la presente invención se relaciona con el DPV anterior que puede facilitar la penetración de una sustancia de interés dentro de los núcleos celulares. La definición y descripción detallada aquí adelante están dirigidas a DPV15, DPV15b y DPV3, 3/10, 6, 7, 7b, 10, 10/6.

Definiciones y descripción detallada de la invención Las secuencias de aminoácidos anteriores son capaces de reaccionar in vivo con los aminoglicanos o glicoaminoglicanos y más particularmente con heparina, sulfatos de condroitina y sus derivados.

El mecanismo para internalización del péptido (secuencia de aminoácidos) de acuerdo con la invención, y por lo tanto de las sustancias de interés acopladas a dicho péptido, es por lo tanto dependiente de la energía. La vectorización que utiliza los péptidos anteriores es por lo tanto destacada por el hecho que no viene de un sistema pasivo. En consecuencia las secuencias de aminoácidos de acuerdo con la invención se caracterizan por su capacidad de cruzar la membrana celular y reaccionar in vivo con los aminoglicanos, los glicoaminoglicanos, los sulfatos aminoglicano, las condroitinas y los sulfatos de condroitina.

Los péptidos de acuerdo con la invención son por lo tanto destacados porque tienen la capacidad de cruzar las membranas celulares mediante un mecanismo activo, luego alojarse en el citoplasma y/o los núcleos celulares y así para hacer posible tener un vector cuyo uso no se limita, cuando se pasa dentro de la célula, por el tamaño de las sustancias que se van a trasportar. De hecho, los vectores (constituidos por o que comprenden el péptido/aminoácido) de acuerdo con la invención son capaces de transportar los fármacos, que varían de moléculas químicas pequeñas (bajo peso molecular) a proteínas o ácidos nucleicos tipo plásmido (alto peso molecular) .

El uso de estos vectores que abre una nueva ruta en la terapia de proteína intracelular o terapia génica. Esta capacidad especial de los vectores en la invención para penetración la hace posible para los fármacos objetivo en las células en una forma preferencial, contribuyendo así a una reducción potencial en la toxicidad de los fármacos y un aumento potencial en el índice de eficacia.

"Derivados de heparina o de sulfato de condroitina" o "aminoglicanos como heparina o sulfato de condroitina" se entiende que significan cualquier producto o sub-producto como se define en la técnica anterior (Cardin A.D. & Weintraub H.J.R. Arteriosclerosis 9:21 (1989) ; Merton B. et al. Annu. Rev. Cell Biol. 8:365 (1992) ; David G. FASEB J. 7:1023 (1993) ) .

Se entiende que "facilitar la penetración" significa facilitar el pasaje o traslado de una sustancia desde el medio externo al medio intracelular, y muy específicamente en el citoplasma y/o el núcleo de la célula. Esta penetración se puede determinar mediante diversos procesos, por ejemplo mediante una prueba de penetración celular que tiene una primera etapa de incubación para las secuencias de aminoácidos en la presencia de las células cultivadas, seguido por una etapa de fijación y permeabilización de aquellas células, y luego revelación de la presencia de dicha secuencia de aminoácidos dentro de la célula. La etapa de revelación se puede hacer con otra incubación en la presencia de los anticuerpos marcados y dirigidos contra dicha secuencia, seguida por detección en el citoplasma o en proximidad inmediata de los núcleos celulares, o aún dentro de estos, de la reacción inmunológica entre la secuencia y los anticuerpos marcados. También se puede hacer revelación al hacer una secuencia de aminoácidos en la invención y detectar la presencia de dicha marca en los compartimientos celulares.... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Una secuencia de aminoácidos que es capaz de facilitar la penetración de una sustancia de interés dentro de los núcleos celulares, dicha sustancia de interés se selecciona del grupo que comprende ácido nucleico, proteína, fármaco, antígeno, anticuerpo, polímero, marcador tal como fluorocromo, y dicha secuencia de aminoácidos tiene la siguiente fórmula:

(X1) p X B B B X B X X B X B B B X B XX B (III)

En donde X1 es una secuencia de aminoácidos de 1 a 20 aminoácidos;

p es un número completo entre 0 y 5; B es un aminoácido básico; X es un aminoácidos no básico, preferiblemente hidrófobo, tal como alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina o tirosina.

2. Una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la reivindicación 1, en donde:

- p es 0, y/o

- X1 es una secuencia de 2 a 5 aminoácidos.

3. Una secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 que tiene menos de 100 aminoácidos.

4. Una secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 que tiene entre 18 a 25 aminoácidos.

5. Una secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 tiene la siguiente fórmula:

- Gly Ala Tyr Asp Leu Arg Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg Leu Arg Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg (SEQ ID NO.2) .

6. Una secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por el hecho que esta se une a un componente en la membrana celular y cruza dicha membrana celular por medio de dicho componente.

7. Una secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por el hecho que es capaz de reaccionar con los aminoglicanos.

8. Una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado por el hecho que es capaz de reaccionar con los glicoaminoglicanos.

9. La secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, caracterizado por el hecho que es capaz de reaccionar con heparina, sulfatos de condroitina y sus derivados.

10. Una secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, acoplada a una secuencia derivada de un fragmento de anticuerpo, ventajosamente un fragmento de anticuerpo polirreactivo.

11. La secuencia de aminoácidos de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la segunda secuencia de aminoácidos es toda o parte de una región hipervariable de un anticuerpo.

12. Una secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11, en donde la segunda secuencia de aminoácidos es un fragmento de la cadena pesada de un anticuerpo.

13. Una secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en donde la segunda secuencia de aminoácidos es un anticuerpo anti-ADN humano o parte del mismo.

14. La secuencia de aminoácidos de la reivindicación 13, en donde dicho anticuerpo se selecciona entre el grupo que comprende IgM y IgG.

15. La secuencia de aminoácidos de la reivindicación 10, en donde la segunda secuencia de aminoácidos se selecciona del grupo que comprende toda o parte de una región CDR2, CDR3 de un anticuerpo.

16. El uso de una secuencia de aminoácidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para preparar una composición para la transferencia de dicha sustancia de interés dentro de las células.

17. Un vector para transferencia intracitoplásmica y/o intracistosólica y/o intranuclear de dicha sustancia de interés, constituido por o que comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.

18. El vector de la reivindicación 17 acoplado a por lo menos una de dicha sustancia de interés que se puede incorporar en forma natural o no natural dentro de las células y/o los núcleos de dichas células.

19. El vector de la reivindicación 18, en donde dicha sustancia de interés se acopla en el extremo del termina N o C de la secuencia de aminoácidos.

20. Un vector de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico se selecciona del grupo que comprende ADN, ARN, siARN, dsARN, SsARN y aARN.

21. Un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, en donde dicha sustancia o sustancias de interés se acoplan a dicho vector por medio de por lo menos una molécula de anclaje que tiene una afinidad natural fuerte para dicha sustancia de interés.

22. Un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, en donde la sustancia o sustancias de interés se acoplan a dicho vector mediante ingeniería genética o mediante acoplamiento químico, bioquímico o enzimático.

23. Una célula eucariótica, que excluye células embriónicas humanas, que contienen un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 22.

24. Una composición biológica, farmacéutica, cosmética, agro-alimenticia, diagnóstica o de seguimiento, que comprende como ingrediente activo una secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 22 o una célula eucariótica de acuerdo con la reivindicación 23.

células pg PO/1000

células pg PO/1000

± desviación estándar

± desviación estándar

células pg PO/1000± desviación estándar

concentración DPV-PO inicial ( g/ml)

(

Figura Figura

Figura

células IgG antiPO pg /1000± desviación estándar

Línea 1: Peso Molecular Estándar Línea 2: IgG AntiPOLínea 3: conjugado IgG 15-AntiPO DPVLínea 4: conjugado Ig.

15. AntiPO DPV

Figura

Figura

Figura

Figura Figura células pg TMR /1000± desviación estándar

células pg TMR /1000± desviación estándarcélulas pg TMR /1000± desviación estándar

Figura

Figura Figura Figura 30

Retiro del 10-acetato o desacetoxilación para formarel derivado 10-desacetoxi, Retiro o modificación no hace mayores cambiosde grupos 3'-OH en la actividad reduce la actividad Se pueden utilizardiferentes grupos arilo: algunos proporcionanInteracciones hidrófobas actividad mejorada entre estos grupos sepueden correlacionar con actividad Una contracción del anillo proporciona productos concitotoxicidad reducida perosimilar actividad de polimerización de tubulina al paclitaxel Figura 31

La acilaciòn reduce ligeramente la actividad osignificativamente, dependiendo del grupoacilo. El 7-Desoxipaclitaxel es comparablecon el paclitaxel en su actividad. Laoxigenación enC-6 reduce la actividad, comolo hace la sustitución de un grupo epi-arido para el grupo C-7 OH.

Contracción del anillo C hasta un anillo de cinco miembros reduce la actividad Reemplazo del 2-benzoato con grupos benzoilo sustituidos suministra productos con actividad reducida para grupos benzoilo p-sustituidos pero con aumento de actividad para algunosgrupos m-sustituidos Epimerizaciónen C-2 reduce la actividad.


 

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