Variente de meganucleasa que escinden una secuencia de ADN diana del locus ROSA26 de ratón y usos de las mismas.

Una variante de l-Crel, caracterizada porque uno de los dos monomeros de l-Crel tiene al menos dos sustituciones,

una en cada uno de los dos subdominios funcionales del dominio del nucleo de LAGLlDADG situado respectivamente entre las posiciones 26 a 40 y 44 a 77 de l-Crel, siendo dicha variante capaz de escindir una secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton, y que es obtenible mediante un procedimiento que comprende al menos las etapas de:

(a) construir una primera serie de variantes de l-Crel que tengan al menos una sustitucion en el primer subdominio funcional del dominio del nucleo de LAGLlDADG situado entre las posiciones 26 a 40 de l-Crel, (b) construir una segunda serie de variantes de l-Crel que tengan al menos una sustitucion en un segundo subdominio funcional del dominio del nucleo de LAGLlDADG situado entre las posiciones 44 a 77 de l-Crel, (c) seleccionar y/o cribar las variantes de la primera serie de la etapa (a) que son capaces de escindir un sitio l-Crel mutante en el que al menos (i) el triplete de nucleotidos en las posiciones -10 a -8 del sitio l-Crel se ha sustituido con el triplete de nucleotidos que esta presente en la posicion -10 a -8 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton y (ii) el triplete de nucleotidos en las posiciones +8 a + 10 se ha sustituido con la secuencia complementaria inversa del triplete de nucleotidos que esta presente en la posicion -10 a -8 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton, (d) seleccionar y/o cribar las variantes procedentes de la segunda serie de la etapa (b) que son capaces de escindir un sitio l-Crel mutante en el que al menos (i) el triplete de nucleotidos en las posiciones -5 a -3 del sitio l-Crel se ha sustituido con el triplete de nucleotidos que esta presente en la posicion -5 a -3 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton y (ii) el triplete de nucleotidos en las posiciones +3 a +5 se ha sustituido con la secuencia complementaria inversa del triplete de nucleotidos que esta presente en la posicion -5 a -3 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton, (e) seleccionar y/o cribar las variantes procedentes de la primera serie de la etapa (a) que son capaces de escindir un sitio l-Crel mutante en el que al menos (i) el triplete de nucleotidos en las posiciones +8 a +10 del sitio l-Crel se ha sustituido con el triplete de nucleotidos que esta presente en las posiciones +8 a +10 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton y (ii) el triplete de nucleotidos en las posiciones -10 a -8 se ha sustituido con la secuencia complementaria inversa del triplete de nucleotidos que esta presente en la posicion +8 a +10 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton, (f) seleccionar y/o cribar las variantes procedentes de la segunda serie de la etapa (b) que son capaces de escindir un sitio l-Crel mutante en el que al menos (i) el triplete de nucleotidos en las posiciones +3 a +5 del sitio l-Crel se ha sustituido con el triplete de nucleotidos que esta presente en las posiciones +3 a +5 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton y (ii) el triplete de nucleotidos en las posiciones -5 a -3 se ha sustituido con la secuencia complementaria inversa del triplete de nucleotidos que esta presente en la posicion +3 a +5 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton, (g) combinar en una unica variante, la (s) mutacion (es) en las posiciones 26 a 40 y 44 a 77 de las dos variantes de la etapa (c) y la etapa (d), para obtener una novedosa variante de l-Crel homodimerico que escinda una secuencia en la que (i) el triplete de nucleotidos en las posiciones -10 a -8 es identico al triplete de nucleotidos que esta presente en las posiciones -10 a -8 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton, (ii) el triplete de nucleotidos en las posiciones +8 a +10 es identico a la secuencia complementaria inversa del triplete de nucleotidos que esta presente en las posiciones -10 a -8 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton, (iii) el triplete de nucleotidos en las posiciones -5 a -3 es identico al triplete de nucleotido que esta presente en las posiciones -5 a -3 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton y (iv) el triplete de nucleotidos en las posiciones +3 a +5 es identico a la secuencia complementaria inversa del triplete de nucleotidos que esta presente en las posiciones -5 a -3 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton, y/o (h) combinar en una unica variante, la (s) mutacion (es) en las posiciones 26 a 40 y 44 a 77 de las dos variantes procedentes de la etapa (e) y etapa (f), para obtener una novedosa variante de l-Crel heterodimerico que escinda una secuencia en la que (i) el triplete de nucleotidos en las posiciones +3 a +5 es identico al triplete de nucleotidos que esta presente en las posiciones +3 a +5 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton, (ii) el triplete de nucleotidos en las posiciones -5 a -3 es identico a la secuencia complementaria inversa del triplete de nucleotido que esta presente en las posiciones +3 a +5 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton, (iii) el triplete de nucleotidos en las posiciones +8 a +10 del sitio l-Crel se ha sustituido con el triplete de nucleotidos que esta presente en las posiciones +8 a +10 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton y (iv) el triplete de nucleotidos en las posiciones -10 a -8 es identico a la secuencia complementaria inversa del triplete de nucleotidos en las posiciones +8 a +10 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton, (i) combinar las variantes obtenidas en las etapas (g) y/o (h) para formar heterodimeros, y (j) seleccionar y/o cribar los heterodimeros de la etapa (i) que son capaces de escindir dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton.

Variantes de meganucleasa que escinden una secuencia de ADN diana del locus ROSA26 de raton y usos de las mismas La invencion se refiere a una variante de meganucleasa que escinde una secuencia de ADN diana del locus ROSA26 de raton, a un vector que codifica dicha variante, a una celula, un animal o una planta modificada por dicho vector y al uso de dicha variante de meganucleasa y productos derivados para la genomanipulacion del genoma de raton (produccion de proteina recombinante, construccion de ratones transgenicos y lineas recombinantes de celulas de raton) . El locus ROSA26 de raton fue descubierto por Friedrich y Soriano en 1991 mediante un experimento de atrapamiento de genes usando embriocitoblastos (ES) infectados con un retrovirus (Friedrich, G. y P. Soriano, Genes & Development, 1991, 5, 1513-1523) . La linea ROSA26 de atrapamiento de genes de ratones, en la que se produce la insercion en el intron 1 del locus ROSA26, un sitio no esencial, muestra la expresion ubicua del gen indicador durante el desarrollo embrionico, en crias (Friedrich y Soriano, 1991, citado anteriormente) y en celulas hematopoyeticas (Zambrowicz y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94, 3789-3794) . El locus ROSA26, localizado en el cromosoma 6 de raton, produce tres transcritos (Figura 1) . Dos transcritos proceden de un promotor comun que comparte extremos 5' identicos (exon 1 y exon de inicio 2) , pero ninguno contiene un ORF significativo. Y un tercero procedente de la cadena inversa (Zambrowicz y col., 1997, citado anteriormente) . Los transgenes bajo el control del promotor ROSA26 de raton muestran una expresion ubicua en embriones y adultos de raton (Soriano, P., Nature Genetics, 1999, 21, 70-71) . El direccionamiento del locus ROSA26 en celulas ES de raton ha sido ampliamente usado para la construccion de modelos de ratones transgenicos (Kisseberth y col., Developmental Biology, 1999, 214, 128-138; Mao X. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96, 5037-5042; Soriano, 1999, citado anteriormente; A watramani y col., Nature Genetics, 2001, 29, 257-259; Mao X. y col., Blood, 2001, 97, 324-326; Possemato y col., Genesis, 2002, 32, 184-186; Mao, J. y col., Nucleic Acids Res., 2005, 33, e155; Yu y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2005, 102, 8615-8620; Solicitudes PCT lnternacionales WO 99/53017, WO 02/098217, WO 03/020743, WO 2004/063381 y WO 2005/116070) ) .

Sin embargo, la eficacia de la recombinacion homologa en celulas de raton es muy baja (frecuencia: 10-6 a 10-9) . Se puede aumentar esta eficacia mediante una rotura del ADN bicatenario (DSB) en el locus diana. Dichos DBS se pueden crear mediante meganucleasas, que son por definicion endonucleasas especificas de secuencia que reconocen grandes secuencias (Thierr y , A. y B. Dujon, Nucleic Acids Res., 1992, 20, 5625-5631) . Estas proteinas pueden escindir sitios unicos en celulas vivas, mejorando por tanto el direccionamiento genico en 1000 veces o mas en la proximidad del sitio de escision (Puchta y col., Nucleic Acids Res., 1993, 21, 5034-5040; Rouet y col., Mol. Cell. Biol., 1994, 14, 8096-8106; Choulika y col., Mol. Cell. Biol., 1995, 15, 1968-1973; Puchta y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1996, 93, 5055-5060; Sargent y col., Mol. Cell. Biol., 1997, 17, 267-277; Cohen-Tannoudji y col., Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 1444-1448; Donoho, y col., Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 4070-4078; Elliott y col., Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 93-101) . Sin embargo, aunque se han identificado algunos cientos de meganucleasas naturales, denominadas tambien como "endonucleasas de asentamiento" (Chevalier, B.S. y B.L. Stoddard, Nucleic Acids Res., 2001, 29, 3757-3774) , el repertorio de secuencias escindibles esta demasiado limitado a dirigir la complejidad de los genomas, y no existen 45 normalmente sitios escindibles en un gen seleccionado. Teoricamente, la preparacion de meganucleasas con especificaciones adaptadas esta bajo intensa investigacion. De este modo, se esta investigando profundamente sobre la preparacion de meganucleasas con especificidades a medida Recientemente, la fusion de proteinas de dedo de cinc con el dominio catalitico de Fokl, una endonucleasa de 50 restriccion de tipo llS, se uso para preparar endonucleasas especificas de secuencia funcionales (Smith y col., Nucleic Acids Res., 1999, 27, 674-681; Bibikova y col., Mol. Cell. Biol., 2001, 21, 289-297; Bibikova y col., Genetics, 2002, 161, 1169-1175; Bibikova y col., Science, 2003, 300, 764; Porteus, M.H. y D. Baltimore, Science, 2003, 300, 763-; Alwin y col., Mol. Ther., 2005, 12, 610-617; Urnov y col., Nature, 2005, 435, 646-651; Porteus, M.H., Mol. Ther., 2006, 13, 438-446; Solicitud PCT lnternacional WO 2007/014275) . Dichas nucleasas podrian usarse recientemente 55 para la genomanipulacion del gen lLR2G en celulas humanas procedentes de linaje linfoide (Urnov y col., Nature, 2005, 435, 646-651) . La especificidad de la union de las proteinas de dedo de cinc de tipo Cys2-His2 (ZFP) , es facil de manipular, debido probablemente a que representan un sistema sencillo (especificamente impulsado por esencialmente cuatro restos por dedo) , y modular (Pabo y col., Annu. Rev. Biochem., 2001, 70, 313-340; Jamieson y col., Nat. Rev. Drug Discov., 2003, 2, 361-368. Los estudios de los laboratorios de Pabo (Rebar, E.J. y C.O. Pabo, Science, 1994, 263, 671-673; Kim, J.S. y C.O. Pabo, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 1998, 95, 2812-2817) , Klug (Choo, Y. y A. Klug, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 11163-11167 ; lsalan M. y A. Klug, Nat. Biotechnol., 2001, 19, 656-660) y Barbas (Choo, Y. y A. Klug, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 11163-11167 ; lsalan M. y A. Klug, Nat. Biotechnol., 2001, 19, 656-660) dieron como resultado un gran repertorio de ZFP artificiales novedosas, capaz de unirse a la mayor parte de las secuencias G/ANNG/ANNG/ANN.

Sin embargo, las ZFP pueden tener sus limitaciones, especialmente en aplicaciones que requieren un nivel muy alto de especificidad, tal como aplicaciones terapeuticas. Se ha demostrado recientemente que la actividad de la nucleasa Fokl en la fusion actua con un sitio de reconocimiento cualquiera o con dos sitios separados por distancias variables mediante un bucle de ADN que incluye la presencia de algunos mutantes de Fokl defectivos de la union con el ADN (Catto y col., Nucleic Acids Res., 2006, 34, 1711-1720) . De esta manera, la especificidad puede degenerar mucho, tal como se ilustra por la toxicidad en celulas de mamiferos y Drosophila (Bibikova y col., Genetics, 2002, 161, 1169-1175; Bibikova y col., Science, 2003, 300, 764-) .

En la naturaleza, las meganucleasas estan esencialmente representadas por las endonucleasas de asentamiento. Las endonucleasas de asentamiento (HE) son una familia ampliamente distribuida de meganucleasas naturales que incluyen cientos de familias de proteinas (Chevalier, B.S. y B.L. Stoddard, Nucleic Acids Res., 2001, 29, 3757-3774) .

Estas proteinas estan codificadas por elementos geneticos moviles que se propagan mediante un procedimiento denominado "asentamiento": la endonucleasa escinde un alelo analogo del cual esta exento el elemento movil, estimulando por tanto un episodio de recombinacion homologa que duplica el ADN movil en el locus receptor. Dadas sus excepcionales propiedades de escision en terminos de eficacia y especificidad, podria representar un armazon ideal para derivar novedosas endonucleasas muy especificas.

Las HE pertenecen a cuatro familias principales. La familia LAGLlDADG, nombrada de acuerdo con un motivo peptidico conservado implicado en el centro catalitico, es el grupo mas ampliamente distribuido y el mejor caracterizado. En la actualidad se dispone de siete estructuras. Mientras que la mayor parte de las proteinas de esta familia son monomericas y muestran dos motivos LAGLlDADG, unas pocas de estas solo tienen un motivo, pero dimerizan para escindir secuencias diana palindromicas o pseudopalindromicas.

Aunque el peptido LAGLlDADG es la unica region conservada entre los miembros de la familia, estas proteinas comparten una arquitectura muy similar (Figura 2) . El nucleo catalitico esta flanqueado por dos dominios de union al ADN con una simetria en dos pliegues perfecta para los homodimeros tales como l-Crel (Chevalier, y col., Nat. 35 Struct. Biol., 2001, 8, 312-316) e l-Msol (Chevalier y col., J. Mol. Biol., 2003, 329, 253-269) y con una simetria para los monomeros tales como l-Seel (Moure y col., J. Mol. Biol., 2003, 334, 685-69, l-Orol (Silva y col., J. Mol. Biol., 1999, 286, 1123-1136) o l-Anil (Bolduc y col., Genes Dev., 2003, 17, 2875-2888) . Ambos monomeros, o ambos dominios (para las proteinas monomericas) contribuyen al nucleo catalitico, organizado alrededor de cationes divalentes. Exactamente por encima del nucleo catalitico, los dos peptidos LAGLlDADG juegan tambien un papel montar tipica,... [Seguir leyendo]

1. Una variante de l-Crel, caracterizada porque uno de los dos monomeros de l-Crel tiene al menos dos sustituciones, una en cada uno de los dos subdominios funcionales del dominio del nucleo de LAGLlDADG situado respectivamente entre las posiciones 26 a 40 y 44 a 77 de l-Crel, siendo dicha variante capaz de escindir una secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton, y que es obtenible mediante un procedimiento que comprende al menos las etapas de:

(a) construir una primera serie de variantes de l-Crel que tengan al menos una sustitucion en el primer subdominio funcional del dominio del nucleo de LAGLlDADG situado entre las posiciones 26 a 40 de l-Crel,

(b) construir una segunda serie de variantes de l-Crel que tengan al menos una sustitucion en un segundo subdominio funcional del dominio del nucleo de LAGLlDADG situado entre las posiciones 44 a 77 de l-Crel,

(c) seleccionar y/o cribar las variantes de la primera serie de la etapa (a) que son capaces de escindir un sitio l-Crel mutante en el que al menos (i) el triplete de nucleotidos en las posiciones -10 a -8 del sitio l-Crel se ha sustituido con el triplete de nucleotidos que esta presente en la posicion -10 a -8 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton y (ii) el triplete de nucleotidos en las posiciones +8 a + 10 se ha sustituido con la secuencia complementaria inversa del triplete de nucleotidos que esta presente en la posicion -10 a -8 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton,

(d) seleccionar y/o cribar las variantes procedentes de la segunda serie de la etapa (b) que son capaces de escindir un sitio l-Crel mutante en el que al menos (i) el triplete de nucleotidos en las posiciones -5 a -3 del sitio l-Crel se ha sustituido con el triplete de nucleotidos que esta presente en la posicion -5 a -3 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton y (ii) el triplete de nucleotidos en las posiciones +3 a +5 se ha sustituido con la secuencia complementaria inversa del triplete de nucleotidos que esta presente en la posicion -5 a -3 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton,

(e) seleccionar y/o cribar las variantes procedentes de la primera serie de la etapa (a) que son capaces de escindir un sitio l-Crel mutante en el que al menos (i) el triplete de nucleotidos en las posiciones +8 a +10 del sitio l-Crel se ha sustituido con el triplete de nucleotidos que esta presente en las posiciones +8 a +10 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton y (ii) el triplete de nucleotidos en las posiciones -10 a -8 se ha sustituido con la secuencia complementaria inversa del triplete de nucleotidos que esta presente en la posicion +8 a +10 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton,

(f) seleccionar y/o cribar las variantes procedentes de la segunda serie de la etapa (b) que son capaces de escindir un sitio l-Crel mutante en el que al menos (i) el triplete de nucleotidos en las posiciones +3 a +5 del sitio l-Crel se ha sustituido con el triplete de nucleotidos que esta presente en las posiciones +3 a +5 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton y (ii) el triplete de nucleotidos en las posiciones -5 a -3 se ha sustituido con la secuencia complementaria inversa del triplete de nucleotidos que esta presente en la posicion +3 a +5 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton,

(g) combinar en una unica variante, la (s) mutacion (es) en las posiciones 26 a 40 y 44 a 77 de las dos variantes de la etapa (c) y la etapa (d) , para obtener una novedosa variante de l-Crel homodimerico que escinda una secuencia en la que (i) el triplete de nucleotidos en las posiciones -10 a -8 es identico al triplete de nucleotidos que esta presente en las posiciones -10 a -8 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton, (ii) el triplete de nucleotidos en las posiciones +8 a +10 es identico a la secuencia complementaria inversa del triplete de nucleotidos que esta presente en las posiciones -10 a -8 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton, (iii) el triplete de nucleotidos en las posiciones -5 a -3 es identico al triplete de nucleotido que esta presente en las posiciones -5 a -3 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton y (iv) el triplete de nucleotidos en las posiciones +3 a +5 es identico a la secuencia complementaria inversa del triplete de nucleotidos que esta presente en las posiciones -5 a -3 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton, y/o

(h) combinar en una unica variante, la (s) mutacion (es) en las posiciones 26 a 40 y 44 a 77 de las dos variantes procedentes de la etapa (e) y etapa (f) , para obtener una novedosa variante de l-Crel heterodimerico que escinda una secuencia en la que (i) el triplete de nucleotidos en las posiciones +3 a +5 es identico al triplete de nucleotidos que esta presente en las posiciones +3 a +5 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton, (ii) el triplete de nucleotidos en las posiciones -5 a -3 es identico a la secuencia complementaria inversa del triplete de nucleotido que esta presente en las posiciones +3 a +5 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton, (iii) el triplete de nucleotidos en las posiciones +8 a +10 del sitio l-Crel se ha sustituido con el triplete de nucleotidos que esta presente en las posiciones +8 a +10 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton y (iv) el triplete de nucleotidos en las posiciones -10 a -8 es identico a la secuencia complementaria inversa del triplete de nucleotidos en las posiciones +8 a +10 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton,

(i) combinar las variantes obtenidas en las etapas (g) y/o (h) para formar heterodimeros, y

(j) seleccionar y/o cribar los heterodimeros de la etapa (i) que son capaces de escindir dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton.

2. La variante de la reivindicacion 1, en la que dicha (s) sustitucion (es) en el subdominio situado entre las posiciones 44 a 77 de l-Crel son en las posiciones 44, 68, 70, 75 y/o 77 y en la que dicha (s) sustitucion (es) en el subdominio situado entre las posiciones 26 a 40 de l-Crel son en las posiciones 26, 28, 30, 32, 33, 38 y/o 40.

3. La variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que comprende una o mas sustituciones en las posiciones 137 a 143 del l-Crel que modifica la especificidad de la variante hacia el nucleotido en las posiciones

1 a 2, 6 a 7 y/o 11 a 12 del sitio l-Crel.

4. La variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende una o mas sustituciones de la secuencia completa de l-Crel que mejora las propiedades de union y/o escision de la variante hacia dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton, seleccionandose preferiblemente dichas sustituciones entre el grupo que consiste en G19S, l24V, S79G, V105A, K107R, V151A, D153G y K158E.

5. La variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dichas sustituciones son sustituciones de los aminoacidos iniciales con aminoacidos seleccionados en el grupo que consiste en A, D, E, G, H, K, N, P, 0, R, S, T, Y, C, W, L y V.

6. La variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que es un heterodimero, resultante de la asociacion de un primer y un segundo monomero que tienen diferentes mutaciones en las posiciones 26 a 40 y/o 44 a 77 de l-Crel, siendo dicho heterodimero capaz de escindir una secuencia de ADN diana no palindromico procedente del locus ROSA26 de raton.

7. La variante de la reivindicacion 6, en la que dicho ADN diana se selecciona entre el grupo que consiste en las secuencias SE0 lD NO; 5 a 14 y 16 a 30, dicho primer y segundo monomeros, respectivamente, comprendiendo preferiblemente al menos las siguientes sustituciones:

- N30H, Y33S, 044E, R68C, R70S, D75N and N30D, Y33R, 038T, 044K, R68E, R70S, l77R,

- S32N, Y33G, 044K, R70E, D75N and S32T, 038W, 044K, R68E, R70S, l77R,

- Y33R, 038N, S400, 044N, R70S, D75R, l77D and N30H, Y33S, 044A, R70S, D750, l77E,

- K28S, 038R, S40K, 044D, R68Y, R70S, D75S, l77R and Y33C, 038A, R68A, R70K, D75N,

- Y33C, 044T, R70S, D75Y and S32D, 038C, 044D, R68Y, R70S, D75S, l77R,

- S32T, Y33C, R68T, R70N, D75N and S32T, 038W, 044K, R70E, D75N,

- R70S, D75R, l77Y and Y33R, 038A, S400, 044A, R70S, D75N,

- K28S, 038R, S40K, 044T, R68N, R70N, D75N and Y33H, 038S, 044K, R68Y, R70S, D750, l77N,

- K28A, Y33S, 038R, S40K, 044N, R68Y, R70S, D75R, l77V and S32T, Y33C, 044A, R70S, D75N,

- S32D, Y33H, 044K, R68E, R70S, l77R and S32D, Y33H, 044D, R68N, R70S, D75N,

- N30R, S32D, R68S, R70K, D75N and D75N,

- K28R, Y33A, 038Y, S400, R68Y, R70S, D75R, l770 and Y33R, 038A, S400, R70S, l77K,

- K28R, N30D, D75E, l77R and S32D, 038C, 044A, R70S, D75R, l77Y,

- Y33R, 038A, S400, R70S, D75N and R70S, D75Y, l77R,

- Y33R, 038A, S400, 044N, R68Y, R70S, D75R, l77V and N30R, S32D, 044T, R68H, R70H, D75N,

- Y33P, S400, 044K, R68Y, R70S, D750, l77N and S32A, Y33C, R68Y, R70S, D75R, l770,

- K28A, Y33S, 038R, S40K, R68N, R70S, D75N, l77R and S32N, Y33G, 044A, R68A, R70K, D75N,

- N30H, Y33S, 044Y, R70S, l77V and Y33R, S400, 044A, R70S, D75N,

- S32D, Y33H, R68T, R70N, D75N and N30R, S32D, 044T, R68N, R70N, D75N,

- S32R, Y33D, 044A, R70S, D75N and Y33S, 038R, S40H, R68H, R70H, D75N,

- Y33P, S400, 044K, R68Y, R70S, D750, l77N and K28R, Y33A, 038Y, S400, 044T, R68H, R70H, D75N,

- K280, 038R, S40K, 044A, R70S, D75E, l77R and N30R, S32D, 044K, R68Y, R70S, D750, l77N,

- Y33T, 038A, R68H, R70H, D75N and N30H, Y33S, R70S, l77K,

- Y33T, S40T, R68A, R70K, D75N and K28R, Y33A, 038Y, S400, R70S, and

- S32D, Y33H, 044N, R70S, D75R, l77D and S32D, 038C, R70S, l77K.

8. La variante de la reivindicacion 7, en la que el primer monomero es de cualquiera de las secuencias SE0 lD NO: 82 a 106 y el segundo monomero es de cualquiera de las secuencias SE0 lD NO: 107 a 116, 4, 117 a 130, respectivamente.

9. La variante de la reivindicacion 6, en la que dicho ADN diana es la SE0 lD NO: 15 y en la que el primer monomero se selecciona entre el grupo que consiste en: l24V, 044Y, R70S y D75N ; l24V, 044Y, R68Y, R70S, D75Y e l77R ; l24V, 044Y, R70S, D75N e l77V ; 124V, 044Y, R68N, R70S y D75R; l24V, 044Y, R68S, R70S y D75R; l24V, 044Y, R70S y D750 ; l24V, 044Y, R68Y, R70S, D75R e l77V ; l24V, 044Y, R70S, D75Y e l77T, y el segundo monomero se selecciona en el grupo que consiste en K28E, Y33R, 038R, S40R, 044A, R68H, R700 y D75N; K28E, Y33R, 038R, S40R, 044A, R70N y D75N; K28E, Y33R, 038R, S40K, 044A, R68H, R700 y D75N ; K28E, Y33R, 038R, S40K, 044V, R70A y D75N; K28E, Y33R, 038R, S40K, 044A, R70G y D75N, preferiblemente el primer monomero se selecciona entre el grupo que consiste en las secuencias SE0 lD NO : 39, 43, 45, 49, 50, 51, 53 y 54, y el segundo monomero se selecciona entre el grupo que consiste en las secuencias SE0 lD NO: 60, 61, 63, 65 y 66.

10. La variante de la reivindicacion 6 en la que dicho ADN diana es la SE0 lD NO: 15 y en el que el primer y el segundo monomero, respectivamente, comprende al menos las siguientes sustituciones: l24V, 044Y, R70S, D75Y, l77T y K28E, Y33R, 038R, S40R, 044A, R68S, R700, D75N, preferiblemente en la que el primer y el segundo monomeros son la SE0 lD NO: 54 y la SE0 lD NO: 62, respectivamente.

11. La variante de la reivindicacion 6 en la que dicho ADN diana es la SE0 lD NO: 15 y en la que el primer monomero se selecciona entre el grupo que consiste en l24V, 044Y, R68N, R70S y D75R; l24V, 044Y, R68S, R70S y D75R; l24V, 044Y, R70S y D750; 124V, 044Y, R68Y, R70S, D75R e l77V; l24V, 044Y, R70S, D75Y e l77T, y el segundo monomero s selecciona en el grupo que consiste en: K28E, Y33R, 038R, S40K, 044A, R70S, D75N y K28E, Y33R, 038R, S40K, 044A, R68T, R70N, D75N, preferiblemente en la que el primer monomero se selecciona entre el grupo que consiste en las secuencias SE0 lD NO: 49, 50, 51, 53 y 54, y el segundo monomero se selecciona entre el grupo que consiste en las secuencias SE0 lD NO: 64 y 67.

12. La variante de la reivindicacion 6 en la que dicho ADN diana es la SE0 lD NO: 15 y en la que el primer monomero se selecciona entre el grupo que consiste en las secuencias SE0 lD NO: 72 y 73 y el segundo monomero se selecciona entre el grupo que consiste en las secuencias SE0 lD NO: 74 a 77.

13. La variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende una senal de localizacion nuclear y/o una etiqueta.

14. La variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que tiene al menos un 95% de identidad de la secuencia con las secuencia.

8. 106.

10. 116, 4.

11. 130; 39, 43, 45, 49, 50, 51, 53 y 54; 60, 61, 63, 65 y 66; 54, 62; 64, 67.

7. 73.

7. 77.

15. La variante de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14, que es un heterodimero obligado, en la que el primer monomero comprende la mutacion D137R y el segundo monomero comprende ademas la mutacion R51D o en la que el primer monomero comprende ademas las mutaciones E8R o E8K y E61 R y el segundo monomero comprende ademas las mutaciones K7E y K96E.

16. Una meganucleasa quimerica monocatenaria que comprende dos monomeros o dominios de nucleo de una variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, o una combinacion de ambas, que comprende preferiblemente el primer y el segundo monomero tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 7, 8 y 9 a 15, junto con un enlazante peptidico.

17. Un fragmento de polinucleotido que codifica la variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o la meganucleasa quimerica monocatenaria de la reivindicacion 16.

18. Un vector de expresion que comprende al menos un fragmento de polinucleotido que codifica al menos una variante monomerica de l-Crel de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o la meganucleasa quimerica monocatenaria de la reivindicacion 16, preferiblemente, dicho vector de expresion comprende dos fragmentos diferentes de polinucleotidos, codificando cada uno, uno de los monomeros de una variante heterodimerica de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 15.

19. Un vector, que incluye una construccion directora que comprende una secuencia que se va a introducir en el locus ROSA26 de raton, flanqueada por secuencias que comparten homologias con las regiones que rodean el sitio de escision del ADN genomico presente en el locus ROSA26 de raton, tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1, 6, 7 y 9 y en el que preferiblemente dicha secuencia que comparte homologias con las regiones que rodean el sitio de escision del ADN genomico presente en el locus ROSA26 de raton es un

fragmento del locus ROSA26 de raton que comprende la secuencia seleccionada entre las posiciones 3131 a 3330, 3401 a 3600, 4628 a 4827, 5495 a 5694, 5519 a 5718, 5817 a 6016, 5903 a 6102, 6320 a 6519, 7305 a 7504, 7981 a 8180, 8215 a 8414, 8305 a 8504, 8494 a 8693, 8589 a 8788, 8660 a 8859, 8921 a 9120, 9191 a 9390, 9467 a 9666, 10174 a 10373, 11469 a 11668, 12302 a 12501, 12325 a 12524, 12446 a 12465, 12702 a 12901, 12815 a 13014 y 12865 a 13064 de la SE0 lD NO: 3 o dicha secuencia que comparte homologias con las regiones que rodean el sitio de escision del ADN genomico presente en el locus ROSA26 de raton es un fragmento del locus ROSA26 de raton que comprende secuencias en la direccion 5' y en la direccion 3' del sitio de escision, con el fin de permitir la delecion de las secuencias de codificacion que flanquean inmediatamente el sitio de escision.

20. Una composicion que comprende al menos una variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, una meganucleasa quimerica monocatenaria de la reivindicacion 16, y/o al menos un vector de expresion de las reivindicaciones 18 o 19, preferiblemente dicha composicion comprende una construccion de ADN director que comprende una secuencia que se va a introducir en el locus ROSA26 de raton, flanqueada por secuencias que comparten homologias con la region que rodea el sitio de escision del ADN genomico de dicha variante, tal como se define en la reivindicacion 19.

21. Una celula hospedadora que esta modificada por un polinucleotido de la reivindicacion 17 o un vector de las reivindicaciones 18 o 19.

22. Un animal transgenico no humano que comprende uno o dos fragmentos de polinucleotidos tal como se define en la reivindicacion 17 o en la reivindicacion 18.

23. Una planta transgenica que comprende uno o dos fragmentos de polinucleotidos tal como se define en la reivindicacion 17 o en la reivindicacion 18.

24. Uso de al menos una variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, una meganucleasa quimerica monocatenaria de la reivindicacion 16, un vector de acuerdo con las reivindicaciones 18 o 19, para genomanipular el genoma de raton, para objetivos no terapeuticos, en el que preferiblemente dicha variante, meganucleasa quimerica monocatenaria, o vector esta asociada con una construccion de ADN director tal como se define en la reivindicacion 19 y mas preferiblemente, dicha construccion de ADN director comprende un casete que comprende una secuencia de ADN que codifica un producto de interes, y eventualmente un gen marcador, flanqueado por secuencias que comparten homologias con las regiones que rodean el sitio de escision del ADN genomico presente en el locus ROSA26 de raton, tal como se define en la reivindicacion 19.