Composición para inmovilizar y encapsular células funcionales y viables o sustancias bioactivas que comprende:

a) una disolución de polisacárido líquida de quitosano neutro isotónico; y b) una disolución reticulante que consiste en hidroxietilcelulosa tratada con glioxal disuelta en un medio fisiológico

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a una composición y a un procedimiento de aplicación para encapsular células vivas con una disolución de gel de quitosano isotónica neutra que puede solidificarse in situ con la ayuda de un agente reticulante citocompatible que consiste en hidroxietilcelulosa tratada con glioxal disuelta en un medio fisiológico para ayudar a la regeneración de tejidos o la cicatrización de heridas.

Descripción de la técnica anterior

1) Disoluciones líquidas de quitosano

El quitosano con un grado de desacetilación (DDA) de entre el 50% de DDA y el 100% de DDA puede solubilizarse completamente en disoluciones acuosas ácidas que presentan un pH por debajo del pKa aparente del quitosano (de pH 2,5 a pH 6,0). Tales disoluciones de quitosano son incompatibles con la viabilidad celular. Los intentos de elevar el pH hasta niveles citocompatibles con la mayoría de los tampones provocarán que la disolución precipite, a menos que, tal como mostró anteriormente el solicitante, el tampón utilizado sea una sal dibásica de poliol-fosfato (fosfato de glicerol, GP) (publicación de patente de Chenite WO 99/07416). Disoluciones líquidas de quitosano/GP de pH de 6,8 a 7,2 son citocompatibles y termogelificantes. Sin embargo, las disoluciones de quitosano/GP que pueden gelificar a temperaturas próximas a la temperatura corporal contienen concentraciones salinas bastante más allá de los límites citocompatibles (8% de disodio-GP es -360 nM, o 1080 mOsm). La temperatura de termogelificación es inversamente proporcional a la concentración de GP, de manera que la disminución de la concentración de GP hasta niveles isotónicos de sal (3% de disodio-GP, -126 mM, 378 mOsm) da como resultado una disolución que es termogelificante a temperaturas no fisiológicas, por encima de 65ºC. Por tanto, pueden generarse disoluciones de quitosano líquidas citocompatibles utilizando quitosano solubilizado con ácido que se ha llevado hasta una tonicidad y un pH citocompatibles con GP, sin embargo, estas disoluciones no pueden gelificarse en una placa Petri o una cavidad corporal abierta. 2) Geles reticulados a partir de disoluciones de quitosano líquidas

Se han propuesto muchos agentes reticulantes químicos para formar geles sólidos a partir de quitosano líquido, incluyendo glioxal (Freeman, documento USP 5.489.401, 1996), glutaraldehído (Hsien T-Y y Rorrer GL Ind Eng Chem Res. 36:3631-3638, 1997; Oyrton AC Montiero Jr y Airoldi C. Internat. J. Biological Macromolecules. 26:119-128, 1999; Kumbar, SG, et al., J. Microencapsulation 19:173-180, 2002; y Mi, F-L, et al., Biomaterials. 23:181-191, 2002), escuarato (DeAngelis AA, et al., Macromolecules 31:1595-1601, 1998), oligo(óxido de etileno) (Rogovina SZ et al., Polymer Science, 43: 265-268, 2001), tetrametoxipropano (Capitani D, et al., Carbohydrate Polymers 45:245252, 2001) y genepina (Mi, F-L, et al., Biomaterials. 23:181-191, 2002). Una invención anterior ha enseñado también que puede inducirse la gelificación de disoluciones de quitosano neutras utilizando disoluciones de glioxal de entre el 0,01% y el 10% en peso de glioxal u otro agente reticulante bifuncional (Chenite et al. documento WO02/40070). Sin embargo, estas concentraciones de glioxal son tóxicas para las células.

Se ha inventado anteriormente un procedimiento para atrapar células vivas en un gel de quitosano utilizando precipitación dependiente del pH y agentes reticulantes no covalentes, en contraposición a un agente reticulante químico (Aebischer et al., patente US nº 5.871.985). Sin embargo, este mecanismo de gelificación dependiente del pH conduce a una forma de pasta de quitosano que carece de las propiedades adhesivas y mecánicas de los geles de quitosano descritos en la presente memoria, y presentarían una utilización limitada en el campo de aplicaciones de reparación de cartílago en las que el gel ha de aplicarse a una superficie de tejido en una cavidad corporal abierta tal como la articulación sinovial.

En una invención anterior (documento WO02/00272), se propuso una disolución líquida de quitosano-GP citocompatible para su utilización en la encapsulación de células para la regeneración o reparación de tejidos basándose en las propiedades termogelificantes de la disolución de quitosano-GP líquida. Se describió la retención de células viables en un gel de quitosano sólido con una composición de quitosano-GP, glucosamina e hidroxietilcelulosa. En una publicación separada (Li y Xu, J. pharm. Sci 91(7): 1669-1677, 2002), se propuso la hidroxietilcelulosa como agente reticulante citocompatible de geles de quitosano-GP neutros para la encapsulación de células a través de un mecanismo propuesto de puentes de hidrógeno. La presente invención se diferencia completamente de estas descripciones previas, al enseñar un procedimiento y una composición para encapsular células vivas utilizando un mecanismo de reticulación a base de glioxal de disoluciones de quitosano-GP que da como resultado la retención de células viables en geles solidificados.

Resumiendo la técnica anterior, se han reticulado disoluciones de ácido-quitosano con una serie de agentes reticulantes bifuncionales sin pruebas de que estas disoluciones gelificantes puedan mantener la viabilidad celular. Por tanto, existe actualmente una falta de pruebas referentes a la encapsulación de células viables en geles de quitosano químicamente reticulados.

Sería sumamente deseable proporcionar una nueva composición para su utilización en contextos médicos de regeneración y reparación de tejidos.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Un objetivo de la presente invención es proporcionar una disolución líquida polimérica biocompatible cargada con células o factores biológicamente activos, que puede solidificarse y formar un implante o una película con células o factores atrapados o inmovilizados. La disolución puede formar por tanto un armazón sólido biocompatible que mantiene la viabilidad celular, u ofrece la liberación controlada de moléculas bioactivas en el sitio de inyección. Tras la inyección, el implante puede proporcionar un efecto terapéutico a partir de las células, hormonas, fármacos, ADN o agente de carga administrados.

Según la presente invención, se proporciona una composición para inmovilizar y encapsular sustancias bioactivas o células funcionales y viables que comprende:

a) una disolución de polisacárido líquida de quitosano neutro isotónico; y b) una disolución de reticulación que consiste en hidroxietilcelulosa tratada con glioxal, disuelta en medios fisiológicos.

La disolución de reticulación consiste en hidroxietilcelulosa tratada con glioxal disuelta en medios fisiológicos.

El agente reticulante químico se disuelve preferentemente en medios fisiológicos que albergan uno o más nutrientes celulares incluyendo, pero sin limitarse a, glucosa, vitaminas, aminoácidos y agentes tamponantes tal como se encuentran en medios de

cultivo celular típicos.

La composición de la presente invención puede comprender por ejemplo:

a) del 0,5 al 5,0% en peso de quitosano; y

b) el 0,0001 -3% de glioxal, y

c) del 0,01 al 5,0% en peso de hidroxietilcelulosa tratada con glioxal; y

en la que dicha disolución forma un gel entre temperaturas de 4ºC y 42ºC, y más preferentemente entre 20ºC y 42ºC, proporcionando dicho gel un entorno fisiológico para mantener la viabilidad de las células.

La composición forma un gel, preferentemente en el plazo de segundos a varias horas tras mezclar (a) y (b), y (c).

El quitosano se disuelve preferentemente en ácido diluido y se mezcla con del 1,0 al 2,5% en peso de una sal de poliol que consiste en sal dibásica de monofosfato, tal como sal dibásica de monofosfato de glicerol como sal dibásica de glicerol-2-fosfato, sal dibásica de sn-glicerol-3-fosfato y sal dibásica de L-glicerol-3-fosfato, o sal de monosulfato.

El quitosano puede mezclarse además con sal y tampón fosfato.

En una realización de la invención, la composición comprende además un factor biológicamente activo. Tal factor puede seleccionarse por ejemplo de entre el grupo constituido por células, una hormona, un fármaco, ADN, un agente de carga, un factor de crecimiento, un ADN, complejos ADN-polímero, liposomas, un agente farmacológico, un factor metabólico, un anticuerpo, un factor nutritivo, un factor angiogénico y un radioisótopo.

En una...

1. Composición para inmovilizar y encapsular células funcionales y viables o

sustancias bioactivas que comprende: a) una disolución de polisacárido líquida de quitosano neutro isotónico; y b) una disolución reticulante que consiste en hidroxietilcelulosa tratada con glioxal disuelta en un medio fisiológico.

2. Composición según la reivindicación 1, en la que la composición comprende: a) del 0,5 al 5,0% en peso de quitosano; y b) del 0,01 al 5,0% en peso de hidroxietilcelulosa tratada con glioxal, en la que dicha disolución forma un gel entre temperaturas de 4ºC y 42ºC,

proporcionando dicho gel un entorno fisiológico para mantener la viabilidad de las células.

3. Composición según la reivindicación 2, que comprende además: c) el 0,0001-3% de glioxal.

4. Composición según la reivindicación 2, en la que la composición forma un gel en un periodo comprendido entre segundos y varias horas tras mezclar (a) y (b).

5. Composición según la reivindicación 3, en la que la composición forma un gel en un periodo comprendido entre segundos y varias horas tras mezclar (a), (b) y (c).

6. Composición según la reivindicación 2, en la que la disolución forma un gel entre temperaturas de 20ºC y 42ºC.

7. Composición según la reivindicación 1, en la que el quitosano se disuelve en ácido diluido y se mezcla con entre el 1,0 y el 2,5% en peso de una sal de poliol que consiste en sal dibásica de monofosfato, o sal de monosulfato.

8. Composición según la reivindicación 7, en la que dicha sal dibásica de monofosfato es sal dibásica de monofosfato de glicerol.

9. Composición según la reivindicación 7, en la que la sal dibásica de monofosfato de glicerol se selecciona de entre el grupo constituido por sal dibásica de glicerol-2-fosfato, sal dibásica de sn-glicerol-3-fosfato y sal dibásica de L-glicerol-3-fosfato.

10. Composición según la reivindicación 1, en la que el quitosano se mezcla además con sal y tampón fosfato.

11. Composición según la reivindicación 1, que comprende además un factor biológicamente activo.

12. Composición según la reivindicación 11, en la que el factor biológicamente activo se selecciona de entre el grupo constituido por células, una hormona, un fármaco, ADN, un agente de carga, un factor de crecimiento, un ADN, complejo ADN-polímero, liposomas, un agente farmacológico, un factor metabólico, un anticuerpo, un factor nutritivo, un factor angiogénico y un radioisótopo.

13. Composición según la reivindicación 12, en la que dichas células son células vivas.

14. Composición según la reivindicación 12, en la que la que las células son del núcleo pulposo, anillos fibrosos o una mezcla de las mismas.

15. Composición según la reivindicación 12, en la que las células son células madre embrionarias no humanas o células madre derivadas de un tejido seleccionado de entre el grupo constituido por médula ósea, tejido adiposo, músculo, cerebro, piel, hígado, músculo liso vascular, endotelio, sangre o placenta.

16. Composición según la reivindicación 12, en la que las células son células primarias, células diferenciadas, células genéticamente modificadas, hibridomas, células inmortalizadas, células transformadas, células de fragmentos de tejido, orgánulos, o una mezcla de las mismas, células nucleadas, células enucleadas, células germinales, células plaquetarias, vesículas matriciales, vesículas celulares, pasta ósea desmineralizada, astillas de hueso, fragmentos de cartílago, o fragmentos de células o fragmentos de tejido.

17. Composición según la reivindicación 12, en la que las células son células autólogas, células alogénicas o células xenogénicas.

18. Composición según la reivindicación 12, en la que el factor biológicamente activo es un factor de unión celular seleccionado de entre el grupo constituido por fibrinógeno, fibrina, fibronectina, ácido hialurónico, heparina, colágeno, polilisina, poliornitina, péptido cíclico de unión a receptores, proteína de unión a receptores.

19. Composición según la reivindicación 12, en la que el factor biológicamente activo es una enzima, un factor de crecimiento o una sustancia inmovilizada por factor de crecimiento.

20. Composición según la reivindicación 12, en la que el factor biológicamente activo es un ADN de plásmido en forma de liposomas, un complejo lipídico, un complejo de quitosano, un complejo de polilisina, un complejo de DEAE dextrano.

21. Composición según la reivindicación 12, en la que el factor biológicamente activo es una vacuna.

22. Composición según la reivindicación 21, en la que la vacuna comprende una partícula viral infecciosa.

23. Composición según la reivindicación 12, en la que el factor biológicamente activo es un factor metabólico o nutritivo.

24. Composición según la reivindicación 23, en la que el factor metabólico o nutritivo es un lípido, aminoácidos y un cofactor seleccionado de entre el grupo constituido por colesterol, glutamina, glucosamina, ácido ascórbico, piruvato y lactato.

25. Composición según la reivindicación 12, en la que el factor biológicamente activo es por lo menos un elemento seleccionado de entre el grupo constituido por sangre periférica, sangre del hueso, sangre del cordón umbilical, un producto sanguíneo, células

transportadas por la sangre, suero, plaquetas, plasma rico en plaquetas, fibrinógeno, un factor de coagulación y una enzima transportada por la sangre.

26. Composición según la reivindicación 12, en la que el factor biológicamente activo es una sustancia osteogénica.

27. Composición según la reivindicación 26, en la que la sustancia osteogénica es un miembro de la familia de proteínas morfogenéticas óseas seleccionado de entre el grupo constituido por TGF-β1, BMP-2, BMP-6, BMP-7 o una mezcla de las mismas.

28. Composición según la reivindicación 1, en la que el polímero que contiene hidroxilo es poli(alcohol vinílico), dextrano, unido con un aldehído reactivo bifuncional.

29. Utilización de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28 para la preparación de un medicamento destinado a la reparación de tejidos blandos.

30. Utilización de la composición según la reivindicación 12 ó 13 para la preparación de un medicamento destinado a la administración específica de sitio de dicho factor biológicamente activo.

31. Utilización de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28 para la preparación de un medicamento destinado a la reparación ósea.

32. Utilización de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28 para la preparación de un medicamento destinado a reparar o resuperficializar el cartílago dañado.

33. Utilización de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28 para la preparación de un medicamento para reparar el menisco.

34. Composición según la reivindicación 1, en la que el medio fisiológico comprende nutrientes celulares seleccionados de entre el grupo constituido por glucosa, aminoácidos y vitaminas, o una combinación de los mismos, a pH neutro e isotónico.