COMPLEJO DE PROTEINA DE CHOQUE TÉRMICO MODIFICADA-PÉPTIDO ANTIGÉNICO.

Una célula cancerosa humana recombinante transfectada con una construcción que expresa una proteína de choque térmico modificada en la célula,

en la que la proteína de choque térmico modificada (i) se secreta por una célula en la que se expresa y se asocia no covalentemente con un péptido antigénico; (ii) carece de una secuencia de retención en retículo endoplásmico presente en la proteína de choque térmico no modificada; y (iii) comprende una etiqueta peptídica

La presente invención se realizó con ayuda gubernamental bajo el número de concesión CA57904 otorgada por el National Institutes of Health. El gobierno tiene ciertos derechos en la invención.

1. INTRODUCCIÓN

La presente invención se refiere a procedimientos para preparar material inmunogénico que es útil como 5 vacuna para la prevención y/o tratamiento del cáncer o de enfermedades infecciosas. La vacuna está compuesta por complejos no covalentes de proteínas de choque térmico (hsp) modificadas, incluyendo, pero sin limitación, hsp70, hsp90, gp96 y proteína disulfuro isomerasa, y péptidos antigénicos. La vacuna es capaz de generar o aumentar la respuesta inmune de un sujeto contra tipos particulares de células cancerosas o infectadas.

2. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 10

2.1. Patobiología del cáncer

El cáncer se caracterizada principalmente por un aumento en el número de células anormales derivadas de un tejido normal dado. El proceso patológico también implica la invasión de tejidos adyacentes por estas células anormales, y la propagación de estas células anormales a ganglios linfáticos regionales y a sitios distantes (metástasis) a través del sistema circulatorio. Los datos clínicos y los estudios de biología molecular indican que el 15 cáncer es un proceso multietapa que comienza con cambios preneoplásicos minoritarios, que pueden progresar en determinadas condiciones a neoplasias.

El crecimiento de células anormales premalignas está ejemplificado por hiperplasia, metaplasia o, más particularmente, displasia (para una revisión de dichas condiciones de crecimiento anormal véase Robbins y Angeil, 1976, Basic Pathology, 2ª Ed., H.B. Saunders Co., Filadelfia, págs. 68-79). La hiperplasia es una forma de 20 proliferación celular controlada que implica un aumento en el número de células en un tejido u órgano sin una alteración significativa en su estructura o función. Como un ejemplo, la hiperplasia endometrial a menudo precede al cáncer endometrial. La metaplasia es una forma de crecimiento celular controlado en la que un tipo de célula adulta o totalmente diferenciada sustituye a otro tipo de célula adulta. La metaplasia puede darse en células de tejidos epiteliales o conjuntivos. La metaplasia típica implica un epitelio metaplásico algo desordenado. La displasia 25 es frecuentemente un precursor del cáncer, y se encuentra principalmente en los epitelios; es la forma más desordenada de crecimiento celular no neoplásico, implicando una pérdida de la uniformidad celular individual y de la orientación arquitectónica de las células. Las células displásicas tienen con frecuencia núcleos anormalmente grandes e intensamente teñidos y presentan pleomorfismo. La displasia aparece característicamente cuando existe una irritación o inflamación crónica, y se encuentra con frecuencia en el cuello uterino, vías respiratorias, cavidad 30 oral y vesícula biliar.

La lesión neoplásica puede evolucionar de forma clonal y desarrollar una capacidad creciente para la invasión, crecimiento, metástasis y heterogeneidad, especialmente en condiciones en las que las células neoplásicas escapan a la vigilancia inmune del huésped (Roitt, I., Brostoff, J. y Male, D., 1993, Immunology, 3ª ed., Mosby, St. Louis, págs. 17.1-17.12). 35

El documento WO 96/10411 desvela un procedimiento para inhibir la proliferación de un tumor en un mamífero por uso de complejos de proteína de estrés/péptido.

El documento WO 95/24923 desvela vacunas que contienen complejos de proteína de estrés/péptido que pueden usarse para inducir una respuesta de células T contra un patógeno intracelular preseleccionado.

Breloer y col. (1998) Euro. J. Immunol. 28(3) 1016-21 desvela una proteína de choque térmico asociada 40 con antígenos peptídicos en el sistema antigénico OVA bien definido.

2.2. Vacunación

La vacunación ha erradicado ciertas enfermedades tales como la polio, el tétanos, la viruela aviar, el sarampión, etc., en muchos países del mundo. Esta estrategia ha aprovechado la capacidad del sistema inmune para prevenir enfermedades infecciosas. Dicha vacunación con materiales no vivos tales como proteínas conduce 45 generalmente a una respuesta de anticuerpos o respuesta de células T auxiliares CD4+ (Raychaudhuri y Morrow, 1993, Immunology Today, 14: 344-348). Por otro lado, la vacunación o infección con materiales vivos tales como células vivas o virus infecciosos conduce generalmente a una respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+. Una respuesta de CTL es crucial para la protección frente a cánceres, virus y bacterias infecciosas. Esto representa un problema práctico, ya que la única forma de conseguir una respuesta de CTL es usar agentes vivos que sean en sí mismos patógenos. El problema se salva generalmente usando cepas víricas y bacterianas atenuadas o destruyendo células completas que pueden usarse para vacunación. Estas estrategias han funcionado bien, pero el uso de cepas atenuadas siempre acarrea el riesgo de que el agente atenuado pueda recombinarse genéticamente 5 con ADN del huésped y convertirse en una cepa virulenta. Por lo tanto, existe la necesidad de procedimientos que puedan conducir a una respuesta de CTL CD8+ por vacunación con materiales no vivos tales como proteínas de una forma específica.

La era de la inmunología tumoral comenzó con los experimentos por Prehn y Main, que demostraron que los antígenos en los sarcomas inducidos por metilcolantreno (MCA) eran específicos de tumor en el sentido de que 10 los ensayos de trasplante no podían detectar estos antígenos en tejido normal de los ratones (Prehn y col., 1957, J. Natl. Cancer Inst. 18: 769-778). Esta idea se confirmó por experimentos adicionales que demostraban que la resistencia específica de tumor contra tumores inducidos por MCA puede generarse en el ratón en el que se originó el tumor (Klein y col., 1960, Cancer Res. 20: 1561-1572).

En estudios posteriores, también se encontraron antígenos específicos de tumores en tumores inducidos 15 con otros carcinógenos químicos o físicos, o en tumores espontáneos (Kripke, 1974, J. Natl. Cancer Inst. 53: 1333-1336; Vaage, 1968, cancer Res. 28: 2477-2483; Carswell y col., 1970, J. Natl. Cancer Inst. 44: 1281-1288). Puesto que estos estudios usaban la inmunidad protectora contra el crecimiento de tumores trasplantados como criterio para antígenos específicos de tumor, estos antígenos también se denominan comúnmente “antígenos de trasplante específicos de tumor” o “antígeno de rechazo específico de tumor”. Varios factores pueden influir enormemente en 20 la inmunogenicidad del tumor, incluyendo, por ejemplo, el tipo específico de carcinógeno implicado, la inmunocompetencia del huésped y el periodo de latencia (Old y col., 1962, Ann. N.Y. Acad. Sci. 101: 80-106; Bartlett, 1972, J. Natl. Cancer Inst. 49: 493-504).

La mayoría, si no todos, los carcinógenos son mutágenos que pueden causar mutación, conduciendo la expresión de antígenos específicos de tumor (Ames, 1979, Science 204: 587-593; Weisburger y col., 1981, Science 25 214: 401-407). Algunos carcinógenos son inmunosupresores (Malmgren y col., 1952, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 79: 484-488). Pruebas experimentales sugieren que existe una correlación inversa constante entre la inmunogenicidad de un tumor y el periodo de latencia (tiempo entre la exposición al carcinógeno y la aparición del tumor) (Old y col., 1962, Ann. N.Y. Acad. Sci. 101: 80-106; y Bartlett, 1972, J. Natl. Cancer Inst. 49: 493-504). Otros estudios han puesto de manifiesto la existencia de antígenos específicos de tumores que no conducen a rechazo pero, no 30 obstante, pueden estimular potencialmente respuestas inmunes específicas (Roitt, I., Brostoff, J. y Male, D., 1993, Immunology, 3ª ed., Mosby, St. Louis, págs. 17. 1-17.12).

2.3. Proteínas de Choque Térmico

Las proteínas de choque térmico (hsp) también se denominan indistintamente proteínas de estrés. Las primeras proteínas de estrés que se identificaron eran proteínas sintetizadas por una célula en respuesta a un 35 choque térmico. Hasta la fecha, se han identificado tres familias principales de hsp basándose en su peso molecular. Las familias se han denominado hsp60, hsp70 y hsp90, en las que los números reflejan el peso molecular aproximado de las proteínas de estrés en kilodaltons. Posteriormente se descubrió que muchos miembros de estas familias se inducían en respuesta a otros estímulos estresantes incluyendo privación...

1. Una célula cancerosa humana recombinante transfectada con una construcción que expresa una proteína de choque térmico modificada en la célula, en la que la proteína de choque térmico modificada (i) se secreta por una célula en la que se expresa y se asocia no covalentemente con un péptido antigénico; (ii) carece de una secuencia de retención en retículo endoplásmico presente en la proteína de choque térmico no modificada; y (iii) comprende una etiqueta peptídica. 5

2. Una célula cancerosa humana recombinante transfectada con una construcción que expresa una proteína de choque térmico modificada en la célula, en la que la proteína de choque térmico modificada (i) se secreta por una célula en la que se expresa y se asocia no covalentemente con un péptido antigénico; (ii) comprende una etiqueta peptídica; y (iii) comprende un péptido líder no presente en la proteína de choque térmico no modificada.

3. Una célula cancerosa humana recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que 10 la proteína de choque térmico modificada se expresa mediante un vector basado en papilomavirus bovino.

4. Una célula cancerosa humana recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la célula cancerosa humana recombinante es una célula de carcinoma pulmonar o carcinoma pulmonar microcítico.

5. Una célula cancerosa humana recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la 15 que la proteína de choque térmico no modificada es la gp96 humana.

6. Una célula cancerosa humana recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la etiqueta peptídica son las regiones constantes de inmunoglobulina G1 o G2 humana.

7. Una célula cancerosa humana recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que administrar dicha célula cancerosa humana recombinante a un individuo induce una respuesta inmune en el 20 individuo contra un antígeno tumoral de la célula cancerosa humana.

8. Una composición farmacéutica que comprende una célula cancerosa humana recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

9. Una célula cancerosa humana recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 8, para su uso como un medicamento. 25

10. Una célula cancerosa humana recombinante o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9, en la que dicho medicamento es para su uso en el tratamiento o la prevención del cáncer.

11. Una célula cancerosa humana recombinante o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 10, en la que el cáncer es carcinoma pulmonar o carcinoma pulmonar microcítico.

12. Una célula cancerosa humana recombinante o una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de 30 las reivindicaciones 9 a 11, en la que la célula cancerosa humana se proporciona por otro individuo distinto de aquel al que se le administra la célula cancerosa humana recombinante o composición farmacéutica.

13. Un procedimiento in vitro de generación de una célula cancerosa humana recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 o reivindicaciones 3 a 6, que comprende transfectar una construcción que expresa un proteína de choque térmico modificada en una célula cancerosa humana, en el que la proteína de choque térmico modificada (i) se 35 secreta por una célula en la que se expresa y se asocia no covalentemente con un péptido antigénico; (ii) carece de una secuencia de retención en retículo endoplásmico presente en la proteína de choque térmico no modificada; y (iii) comprende una etiqueta peptídica.

14. Un procedimiento in vitro de generación de una célula cancerosa humana recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, que comprende transfectar una construcción que expresa una proteína de choque térmico 40 modificada en una célula cancerosa humana, en el que la proteína de choque térmico modificada (i) se secreta por una célula en la que se expresa y se asocia no covalentemente con un péptido antigénico; (ii) comprende una etiqueta peptídica; y (iii) comprende un péptido líder no presente en la proteína de choque térmico no modificada.