CEPAS DE LEVADURA QUE PRODUCEN ESTEROIDES DE FORMA AUTÓNOMA.

Cepa de levadura genéticamente modificada que produce, de manera autónoma a partir de una fuente de carbono sencilla,

un esteroide o un derivado de esteroide, derivado del metabolismo del colesterol, estando comprendido dicho esteroide o derivado de esteroide en el grupo constituido por la pregnenolona, la 17α-hidroxi pregnenolona, el cortisol, la cortexolona, la progesterona, la 17α-hidroxi progesterona, y sus derivados acetilados, hidroxilados o que contienen un derivado halogenado o un grupo metilo, caracterizada porque presenta una inactivación de los genes endógenos ATF2, GCY1 y YPR1

La presente invención se refiere a la producción de esteroides en los microorganismos, principalmente las cepas de levaduras.

Los esteroides, principalmente los esteroides derivados del colesterol, están implicados en numerosos procesos fisiológicos entre los que se pueden citar la regulación de las tasas de glúcidos y colesterol en la circulación sanguínea, el mantenimiento y el desarrollo de la masa muscular, el desarrollo del sistema nervioso central.

Entre los inconvenientes observados en el caso de la desrregulación de las tasas de esteroides circulantes, se pueden citar la activación opcional de enfermedades auto-inmunes, tales como lupus, determinados cánceres, por ejemplo el cáncer de mama, enfermedades cardiovasculares, por ejemplo aterosclerosis. Los problemas de regulación de esteroides se sospechan igualmente en el caso de la activación de determinadas enfermedades neurológicas tales como las enfermedades de Parkinson o de Alzheimer.

Los esteroides, principalmente la hidrocortisona, pueden utilizarse como agentes terapéuticos como tales o como complementos en otros tratamientos. Así, los derivados de síntesis de los glucocorticoides se utilizan por sus acciones anti-inflamatorias y, a altas dosis, inmunosupresoras.

La obtención de los esteroides está actualmente ligada a procedimientos de extracción o de síntesis costosos. John Warcup Cornforth ha sido el primero en realizar la síntesis total de un esteroide, el colesterol, por un método enzimático. Sin embargo, es importante disponer de un método que permita obtener los esteroides de interés, principalmente los derivados del colesterol, a un precio asequible.

Un determinado número de proteínas implicadas en la biosíntesis de los esteroides se han expresado en la levadura. Así, la patente EP 360 361 demuestra la actividad de las proteínas P450 17α y P450c21 en la levadura Kluyveromyces lactis. Asimismo, se ha descrito la posibilidad de conversión in vivo de 11 desoxicortisol en hidrocortisona en una levadura genéticamente modificada que expresa P450c11 (Dumas et al., 1996), así como la producción de 17α-hidroxiprogesterona a partir de pregnenolona en la levadura (Degryse et al., 1999). Además, Duport et al. (Duport et al., 1998) han descrito la síntesis de pregnenolona y de progesterona en una levadura genéticamente modificada. Se ha descrito igualmente en la solicitud de patente WO 99/40203 que la inactivación del gen ATF2 en una cepa de levadura permite evitar la acetilación de los esteroides producidos por esta cepa.

La presente invención permite realizar la síntesis de esteroides, por la fermentación de cepas de levaduras genéticamente modificadas, en presencia de una fuente de carbono sencilla. El método propuesto por la presente invención permite por lo tanto obtener una gran cantidad de esteroides de interés, a bajo coste, porque el procedimiento aplica la fermentación de levaduras y la adición de una fuente de carbono sencilla, fácilmente disponible comercialmente.

Definiciones:

Por fuente de carbono sencilla, según la presente invención, se entienden las fuentes de carbono utilizables por el experto en la técnica para el crecimiento normal de una levadura. Se entiende designar principalmente los diferentes azúcares asimilables, tales como glucosa, galactosa o sacarosa, o las melazas, o los subproductos de estos azúcares. Una fuente de carbono sencilla muy particularmente preferida es el etanol y el glicerol.

Por derivado de un esteroide, se entiende designar, según la presente invención, un compuesto que puede obtenerse, principalmente por una o dos reacciones enzimáticas o químicas, a partir de dichos esteroides. Se entiende particularmente designar los esteroides acetilados, hidroxilados, o que contienen un sustituyente tal como un derivado halogenado (flúor, yodo), o un grupo metilo.

Los problemas a resolver para poder producir los esteroides en un microorganismo son de diferentes clases:

 conviene eliminar las reacciones parásitas que pueden observarse debido a la presencia de enzimas endógenas en el microorganismo elegido,

 conviene introducir los genes que permiten la modificación de los intermedios de síntesis de tal forma que los niveles de expresión obtenidos estén los más próximos posible a los niveles observados en los mamíferos. Así, recrear los buenos equilibrios es una condición importante del éxito de dicho proyecto,

 conviene obtener un nivel de expresión de los diferentes genes que permita orientar preferentemente la biosíntesis hacia el esteroide elegido.

La síntesis de los esteroides es una serie de reacciones extremadamente complejas, en las que participan numerosas enzimas para obtener el cortisol a partir del colesterol.

Conviene producir en primer lugar el 20,22 dihidroxicolesterol, que se transforma en pregnenolona, ella misma hidroxilada en 17-α hidroxi-pregnenolona. Ésta se transforma en 17-α hidroxiprogesterona, que proporciona el desoxicortisol, que lleva al cortisol (hidrocortisona).

Una vía alternativa consiste en la producción de pregnenolona, y progesterona, transformada en 17-α hidroxi-progesterona.

Se ha mostrado que se puede producir pregnenolona en la levadura, a partir de una fuente de carbono sencilla, (Duport et al., 1998, cuyo contenido se incorpora por referencia en la presente solicitud). Para hacer esto, ha sido necesario suprimir una vía endógena (por disrupción del gen Δ22-esteroldesaturasa (ERG5) de la vía de biosíntesis endógena de los ergosteroles), con el fin de obtener una acumulación de productos saturados en C-22. En efecto, el ergosterol normalmente fabricado por la levadura difiere del colesterol en una insaturación en C-7(8) del núcleo B, una insaturación en C-22, y un grupo metilo adicional en C-24. Así, los productos saturados en C-22, y en C-7 en el núcleo B pueden utilizarse como sustratos por las enzimas situadas en la cadena de producción del cortisol.

La presente invención permite realizar la síntesis de esteroides, y principalmente los esteroides situados más abajo que la pregnenolona, de forma sencilla, por la fermentación de cepas de levaduras genéticamente modificadas, en presencia de una fuente de carbono sencilla. En un caso particular de la invención, los esteroides sintetizados se excretan en el medio de cultivo, lo que simplifica su purificación. El método propuesto por la presente invención permite por lo tanto obtener una gran cantidad de esteroides de interés, a bajo coste, porque el procedimiento aplica la fermentación de levaduras y la adición de una fuente de carbono sencilla, fácilmente disponible comercialmente.

De forma preferida, los esteroides que pueden producirse por la cepa de levadura según la invención son esteroides comprendidos en la vía de síntesis del cortisol, así como los enunciados anteriormente. Igualmente, se pueden producir otros tipos de esteroides, a partir de la 17-α hidroxipregnenolona, principalmente la dihidroepiandrosterona (DHEA), por la acción de la enzima 17 αhidroxilasa y liasa, y los esteroides derivados (androstendionas, testosterona...). Estos esteroides pueden producirse por introducción de las enzimas apropiadas en la cepa de levadura, de la misma forma que para la cepa ejemplificada en la presente invención

Para la aplicación del método según la invención, la invención se refiere igualmente a una cepa de levadura, genéticamente modificada, que produce un esteroide o un derivado de esteroide, caracterizada porque permite la producción de manera autónoma a partir de una fuente de carbono sencilla.

El hecho de que la producción se realice de forma autónoma significa que no es necesario añadir sustratos para obtener el esteroide de interés, sino que la levadura puede producirlo a partir únicamente de la fuente de carbono sencilla de partida. También está claro que la cepa puede producir un esteroide de la vía metabólica, mediante la utilización de un sustrato situado anteriormente en la vía metabólica, en la medida en que la cepa de levadura según la presente invención contenga todos los genes necesarios para la terminación de la vía metabólica de producción de los esteroides.

Preferentemente, la cepa de levadura según la invención produce un esteroide o derivado de esteroide que es un derivado del metabolismo del colesterol, es decir, que forma parte de la cadena de metabolismo del colesterol. El metabolismo...

1. Cepa de levadura genéticamente modificada que produce, de manera autónoma a partir de una fuente de carbono sencilla, un esteroide o un derivado de esteroide, derivado del metabolismo del colesterol, estando comprendido dicho esteroide o derivado de esteroide en el grupo constituido por la pregnenolona, la 17α-hidroxi pregnenolona, el cortisol, la cortexolona, la progesterona, la 17α-hidroxi progesterona, y sus derivados acetilados, hidroxilados o que contienen un derivado halogenado o un grupo metilo, caracterizada porque presenta una inactivación de los genes endógenos ATF2, GCY1 y YPR1.

2. Cepa de levadura según la reivindicación 1, caracterizada porque presenta al menos una inactivación adicional de un gen endógeno elegido del grupo constituido por ERG5, ARE1, ARE2, ATF1 y ADE2.

3.Cepa de levadura según la reivindicación 2, caracterizada porque presenta una inactivación de los genes endógenos ERG5, ATF2, GCY1 y YPR1.

4.Cepa de levadura según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque presenta al menos un bloque de expresión para un gen heterólogo integrado en el cromosoma, en al menos un locus elegido entre ADE2, HIS3, TRP1, LEU2, GCY1, ATF2 y YPR1, efectuándose la integración de manera intragénica o intergénica, en proximidad inmediata de dicho locus.

5.Cepa de levadura según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque presenta al menos un bloque de expresión para un gen heterólogo situado en un plásmido multicopia o un plásmido de bajo número de copias.

6.Cepa de levadura según la reivindicación 5, caracterizada porque el plásmido multicopia se elige entre los plásmidos a base de un replicón 2 micrómetros de levadura que se replica en Saccharomyces cerevisiae y porque el plásmido de bajo número de copias se elige entre los plásmidos basados en un origen de replicación ARS cromosómico con un centrómero de levadura.

7. Cepa de levadura según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque presenta al menos un gen o un ADNc heterólogo en un bloque de expresión, eligiéndose dicho gen o ADNc del grupo constituido por el gen de la esterol Δ7-reductasa, de la citocromo P450 SCC, de la adrenodoxina, de la adrenodoxina reductasa, de la 3β-hidroesteroide deshidrogenasa isomerasa, de la citocromo b5, de la citocromo P450 reductasa, de la citocromo P450 C 17, de la citocromo P450 C21, de la citocromo P450 C11, y de las secuencias que codifican estas proteínas.

8. Cepa de levadura según la reivindicación 7, caracterizada porque al menos un gen o ADNc heterólogo está bajo el control de una secuencia promotora elegida del grupo constituido por las secuencias promotoras endógenas de levadura TDH3, TEF1, PGK1, CYC1, GAL10, ATF2, TIR1, ARH1, ADE2, y el promotor híbrido GAL10-CYC1.

9. Cepa de levadura según una de las reivindicaciones 7 u 8, caracterizada porque la secuencia terminadora de al menos un gen o ADNc heterólogo en el bloque de expresión se elige entre las secuencias terminadoras de los genes endógenos PGK1, CYC1, ATF2, ADE2 y NCP1.

10. Cepa de levadura según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque presenta el bloque de expresión heterólogo esterol Δ7-reductasa integrado en el cromosoma en el locus ADE2.

11. Cepa de levadura según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque comprende al menos un casete de expresión de los genes que codifican las formas maduras P450SCC y de la adrenodoxina localizado en un plásmido de alto número de copias.

12. Cepa de levadura según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada porque comprende un casete de expresión de la adrenodoxina reductasa para P450SCC localizado en un plásmido mono o de bajo número de copias, o integrado en uno o varios cromosomas de levadura.

13. Cepa de levadura según la reivindicación 12, caracterizada porque dicho casete de expresión de la adrenodoxina reductasa posee los elementos que aseguran la presencia de la proteína en el citosol de la célula anfitriona.

14. Cepa de levadura según una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizada porque comprende al menos un casete de expresión elegido entre los casetes de expresión de la 3β-hidroesteroide deshidrogenasa isomerasa, de la citocromo P450C 17, de la citocromo P450C21 localizado en un plásmido de alto número de copias.

15.Cepa de levadura según una de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizada porque comprende al menos un casete de expresión para la P45011β situado en un plásmido multicopia, presentando la proteína producida una señal de direccionamiento hacia las mitocondrias.

16.Cepa de levadura según una de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizada porque comprende al menos un casete de expresión para un precursor de la adrenodoxina para P45011β situado en un plásmido multicopia, con un promotor débil, presentando la proteína producida una señal de direccionamiento hacia las mitocondrias.

17.Cepa de levadura según una de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizada porque presenta al menos dos casetes de expresión para la adrenodoxina, de manera tal que una proteína sea activa en el exterior de la mitocondria, siendo la otra activa en las mitocondrias de la célula anfitriona.

18.Cepa de levadura según una de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizada porque comprende al menos un casete de expresión para NCP1, ATR1, y/o ATR2 situado en un plásmido monocopia o integrado en el cromosoma.

19.Cepa de levadura según una de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizada porque expresa la proteína ARH1 a un nivel superior respecto a un nivel fisiológico.

20.Cepa de levadura según la reivindicación 19, caracterizada porque posee, además del gen endógeno, un segundo casete de expresión para la proteína ARH1.

21.Cepa de levadura según la reivindicación 20, caracterizada porque la expresión de la proteína ARH1 está situada bajo el control del promotor CYC1 en dicho casete.

22.Cepa de levadura según una de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizada porque es poliploide, diploide, haploide o aneuploide.

23.Cepa de levadura según una de las reivindicaciones 1 a 22, caracterizada porque se trata de una cepa de Saccharomyces cerevisiae.

24.Cepa de levadura según la reivindicación 22, caracterizada porque se deriva de la cepa FY 1679-28c o de la cepa FY 1679-18b.

25. epa de levadura según una de las reivindicaciones 1 a 24, caracterizada porque posee los elementos necesarios para la excreción del esteroide producido en el medio de cultivo.

26.Procedimiento de producción de un esteroide, caracterizado porque comprende las etapas de fermentación de una cepa de levadura según una de las reivindicaciones 1 a 25 en presencia de una fuente de carbono sencilla y de recuperación del esteroide producido.

27.Preparación farmacéutica que comprende una cepa de levadura según una de las reivindicaciones 1 a 25.