Un polipéptido purificado que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62.

Antecedentes de la invención

Campo técnico

La presente invención se refiere a un antígeno P30 modificado por ingeniería genética, así como a una combinación

o mezcla de antígenos que pueden usarse en la detección de anticuerpos IgM y/o IgG contra Toxoplasma gondii. Además, la presente invención también se refiere a métodos de uso de este antígeno P30 modificado por ingeniería genética y de esta combinación de antígenos, a un método de producción de anticuerpos monoclonales generados contra este antígeno P30 modificado por ingeniería genética, así como a kits y vacunas que contienen el antígeno P30 modificado por ingeniería genética y antígenos presentes en la combinación.

Información antecedente

Toxoplasma gondii es un parásito intracelular obligado que está clasificado entre los coccidios. Este parásito tiene un intervalo de hospedador relativamente amplio, infectando tanto a mamíferos como a aves. El organismo es ubicuo en la naturaleza y existe en tres formas: taquizoíto, quiste y ooquiste (Remington, J. S., McLeod, R., Desmonds, G., Infectious Diseases of the Fetus and Newborn Infant (J. S. Remington y J. O. Klein, Eds.), págs. 140267, Saunders, Filadelfia (1995)). Los taquizoítos, que se encuentran durante la infección aguda, son la forma invasiva capaz de invadir todas las células de mamífero nucleadas. Después de la fase aguda de infección, se forman quistes tisulares denominados bradizoítos dentro de las células hospedadoras y persisten dentro del organismo hospedador durante toda la vida del hospedador. Los quistes son importantes en la transmisión de la infección, especialmente en seres humanos, ya que la ingestión de carne sin procesar o poco cocinada puede dar como resultado la ingestión de bradizoítos que pueden infectar al individuo dando como resultado una infección aguda. Los ooquistes representan una fase de reproducción sexual que se produce solamente en el revestimiento intestinal de la familia del gato, del que se excreta en las heces.

Una infección por T. gondii adquirida a través de carne contaminada o heces de gato en un adulto sano a menudo es asintomática. En mujeres gestantes y en pacientes inmunosuprimidos, el desenlace clínico puede ser muy grave. Una infección aguda con T. gondii adquirida durante la gestación, especialmente durante el primer trimestre, puede dar como resultado la transmisión intrauterina al feto no nato, dando como resultado complicaciones fetales y neonatales graves, incluyendo retraso mental y muerte fetal. El recrudecimiento de una infección por T. gondii previa

o una infección aguda en un individuo inmunosuprimido puede ser patógeno. La encefalitis toxoplásmica es una causa principal de morbilidad y mortalidad en pacientes con SIDA. La infección por toxoplasma también ha demostrado ser una causa significativa de coriorretinitis en niños y adultos.

El diagnóstico de la infección con T. gondii puede establecerse por aislamiento de T. gondii de sangre o fluidos corporales, demostración de la presencia del organismo en la placenta o los tejidos del feto, demostración de la presencia de antígeno por detección de secuencias de ácido nucleico específicas (por ejemplo, sondas de ADN), o detección de inmunoglobulinas específicas contra T. gondii sintetizadas por el hospedador en respuesta a la infección usando ensayos serológicos.

La detección de anticuerpos específicos contra T. gondii y la determinación del título de anticuerpos son herramientas importantes usadas en el diagnóstico de la toxoplasmosis. Los ensayos serológicos usados más ampliamente para el diagnóstico de la toxoplasmosis son el ensayo de colorante de Sabin-Feldman (Sabin, A. B. y Feldman, H. A. (1948) Science 108, 660-663), el ensayo de hemaglutinación indirecta (IHA) (Jacobs, L. y Lunde, M. (1957) J. Parasitol, 43, 308-314), el ensayo de IFA (Walton, B. C. et al. (1966) Am. J. Trop. Med. Hyg. 15, 149-152), el ensayo de aglutinación (Fondation Mérieux, Sérologie de l'Infection Toxoplasmique en Particulier a Son Début: Méthodes et Interpretation des Résultants, Lyon, pág. 182 (1975)) y el ELISA (Naot, Y. y Remington, J. S. (1980) J. Infect. Dis. 142, 757-766). El ensayo de ELISA es uno de los ensayos más sencillos de realizar y están disponibles en el mercado muchos ensayos serológicos automáticos para la detección de IgM e IgG específicas de Toxoplasma.

Los ensayos actuales para la detección de anticuerpos IgM e IgG en individuos infectados pueden variar ampliamente en su capacidad para detectar anticuerpos en suero. Por lo tanto, existe una variación interensayo significativa observada entre los kits disponibles en el mercado. Las diferencias observadas entre los diferentes kits comerciales están causadas principalmente por la preparación del antígeno usado para el ensayo serológico. La mayoría de los kits usan taquizoítos completos o sonicados cultivados en cultivo tisular o en ratones que contienen una alta proporción de material extraparasitario, por ejemplo, células de mamífero, componentes de cultivo tisular, etc. Debido a la ausencia de un antígeno purificado normalizado o método convencional para preparar el antígeno de taquizoíto, no es sorprendente que exista variabilidad interensayo, dando como resultado que diferentes ensayos tengan diferentes características de rendimiento en términos de sensibilidad y especificidad del ensayo.

Dadas las limitaciones de los ensayos serológicos que emplean el antígeno de taquizoíto, como se ha descrito anteriormente, así como los problemas persistentes respecto a la determinación del inicio de la infección, los antígenos recombinantes purificados obtenidos por biología molecular son una alternativa atractiva en el sentido de que pueden purificarse y normalizarse. En la bibliografía, se han clonado y expresado varios genes de Toxo en un hospedador adecuado para producir antígenos Toxo recombinantes inmunorreactivos. Por ejemplo, se han descrito los antígenos Toxo P22 (SAG2), P24 (GRA1), P25, P28 (GRA2), P29 (GRA7), P30 (SAG1), P35, P41 (GRA4), P54 (ROP2), P66 (ROP1) y Toxo P68 (Prince et al. (1990) Mol. Biochem. Parasitol 43, 97-106; Cesbron-Delauw et al. (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. 86, 7537-7541; Johnson et al. (1991) Gene 99, 127-132; Prince et al. (1989) Mol. Biochem. Parasitol. 34, 3-13; Bonhomme et al. (1998) J. Histochem. Cytochem. 46, 1411-1421; Burg et al. (1988) J. Immunol. 141, 3584-3591; Knapp et al. (1989) EPA 431541A2; Mevelec et al. (1992) Mol. Biochem. Parasitol. 56, 227-238; Saavedra et al. (1991) J. Immunol. 147, 1975-1982); EPA 751 147).

Es plausible que ningún antígeno Toxo individual pueda sustituir al taquizoíto en un inmunoensayo de exploración inicial para la detección de inmunoglobulinas específicas contra Toxo. Esto puede deberse a varias razones. En primer lugar, los anticuerpos producidos durante la infección varían con la fase de infección, es decir, los anticuerpos producidos por un individuo infectado varían con el tiempo, reaccionando con diferentes epítopos. En segundo lugar, los epítopos presentes en un antígeno recombinante pueden ser diferentes o menos reactivos que el antígeno nativo preparado a partir del taquizoíto, dependiendo del hospedador usado para la expresión y del esquema de purificación empleado. En tercer lugar, pueden ser necesarios antígenos recombinantes diferentes para detectar las diferentes clases de inmunoglobulinas producidas en respuesta a una infección, por ejemplo, IgM, IgG, IgA e IgE.

Para superar las limitaciones del antígeno de taquizoíto en los términos de la especificidad y sensibilidad del ensayo, se realizó una búsqueda para antígenos Toxo que pudieran usarse en combinación para configurar nuevos ensayos para la detección de inmunoglobulinas específicas de Toxo. Maine et al. (en la Patente de Estados Unidos Nº

6.329.157 B1) desvelan cócteles de antígenos Toxo recombinantes para la detección de IgG e IgM específicas de Toxo. Se determinó que los cócteles de antígenos Toxo mencionados anteriormente podían mejorarse y potenciarse por expresión de Toxo P30 en E. coli como una proteína soluble con modificaciones por ingeniería genética. Este antígeno P30 modificado por ingeniería genética y el cóctel de antígenos mejorado se describirán en más detalle a continuación.

Sumario de la invención

La presente invención incluye un antígeno P30 de Toxoplasma gondii modificado por ingeniería genética, así como una composición que comprende tanto antígeno P30 modificado por ingeniería genética como antígeno P35 de Toxoplasma gondii. Este antígeno... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido purificado que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62.

2. Una secuencia de nucleótidos aislada que comprende, o es complementaria a, la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 61.

3. Un plásmido que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 61.

4. Una composición que comprende un polipéptido, en la que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62.

5. La composición de la reivindicación 4, que comprende además P35 de Toxoplasma gondii.

6. La composición de la reivindicación 4 ó 5, en la que dicha composición es un reactivo de diagnóstico.

7. La composición de la reivindicación 4, en la que dicho polipéptido se produce por medios recombinantes o sintéticos.

8. Un método para detectar la presencia de anticuerpos IgM contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende las etapas de:

a) poner en contacto dicha muestra de ensayo sospechosa de contener dichos anticuerpos IgM con una composición que comprende un polipéptido, en el que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62; y

b) detectar la presencia de complejos de polipéptido/anticuerpo IgM, en el que la presencia de dichos complejos indica la presencia de dichos anticuerpos IgM en dicha muestra de ensayo.

9. Un método para detectar la presencia de anticuerpos IgM contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende las etapas de:

a) poner en contacto dicha muestra de ensayo sospechosa de contener dichos anticuerpos IgM con una composición que comprende un polipéptido, en el que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62, durante un tiempo y en condiciones suficientes para la formación de complejos de antígeno/anticuerpo IgM;

b) añadir un conjugado a los complejos de antígeno/anticuerpo IgM resultantes, durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir que dicho conjugado se una al anticuerpo unido, en el que dicho conjugado comprende un anticuerpo unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable; y

c) detectar la presencia de anticuerpos IgM que puedan estar presentes en dicha muestra de ensayo por detección de la presencia de una señal generada por dicho compuesto generador de señal.

10. Un método para detectar la presencia de anticuerpos IgG contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende las etapas de:

a) poner en contacto dicha muestra de ensayo sospechosa de contener dichos anticuerpos IgG con una composición que comprende: 1) un polipéptido, en el que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62 y 2) P35; y

b) detectar la presencia de complejos de antígeno/anticuerpo IgG, indicando la presencia de dichos complejos la presencia de dichos anticuerpos IgG en dicha muestra de ensayo.

11. Un método para detectar la presencia de anticuerpos IgG contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende las etapas de:

a) poner en contacto dicha muestra de ensayo sospechosa de contener dichos anticuerpos IgG con una composición que comprende: 1) un polipéptido, en la que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62 y 2) P35, durante un tiempo y en condiciones suficientes para la formación de complejos de antígeno/anticuerpo IgG;

b) añadir un conjugado a los complejos de antígeno/anticuerpo IgG resultantes durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir que dicho conjugado se una al anticuerpo unido, en el que dicho conjugado comprende un anticuerpo unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable; y c) detectar los anticuerpos IgG que puedan estar presentes en dicha muestra de ensayo por detección de la presencia de una señal generada por dicho compuesto generador de señal.

12. Un método para detectar la presencia de anticuerpos IgM contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende las etapas de:

a) poner en contacto dicha muestra de ensayo sospechosa de contener dichos anticuerpos IgM con un antianticuerpo específico para dichos anticuerpos IgM durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir la formación de complejos de anti-anticuerpo/anticuerpo IgM;

b) añadir un conjugado a los complejos de anti-anticuerpo/anticuerpo IgM resultantes durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir que dicho conjugado se una al anticuerpo unido, en el que dicho conjugado comprende un polipéptido, en el que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62, unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable; y

c) detectar los anticuerpos IgM que puedan estar presentes en dicha muestra de ensayo por detección de la presencia de una señal generada por dicho compuesto generador de señal.

13. Un método para detectar la presencia de anticuerpos IgG contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende las etapas de:

a) poner en contacto dicha muestra de ensayo sospechosa de contener dichos anticuerpos IgG con un antianticuerpo específico para dichos anticuerpos IgG, durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir la formación de complejos de anti-anticuerpo/anticuerpo IgG;

b) añadir un conjugado a los complejos de anti-anticuerpo/anticuerpo IgG resultantes durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir que dicho conjugado se una al anticuerpo unido, en el que dicho conjugado comprende: 1) un polipéptido, en el que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62, y 2) P35, cada uno unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable; y

c) detectar los anticuerpos IgG que puedan estar presentes en dicha muestra de ensayo por detección de la presencia de una señal generada por cada uno de dichos compuestos generadores de señal.

14. Un método para detectar la presencia de anticuerpos IgM contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto dicha muestra de ensayo sospechosa de contener anticuerpos IgM con un anti-anticuerpo específico para dichos anticuerpos IgM durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir la formación de complejos de anti-anticuerpo IgM;

(b) añadir un antígeno a los complejos de anti-anticuerpo/IgM resultantes durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir que dicho antígeno se una al anticuerpo IgM unido, comprendiendo dicho antígeno un polipéptido, en el que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62; y

(c) añadir un conjugado a los complejos de anti-anticuerpo/IgM/antígeno resultantes, comprendiendo dicho conjugado una composición que comprende un anticuerpo monoclonal o policlonal unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable; y

(d) detectar los anticuerpos IgM que puedan estar presentes en dicha muestra de ensayo por detección de una señal generada por dicho compuesto generador de señal.

15. Un método para detectar la presencia de anticuerpos IgG contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto dicha muestra de ensayo sospechosa de contener anticuerpos IgG con un anti-anticuerpo específico para dichos anticuerpos IgG, durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir la formación de complejos de anti-anticuerpo IgG;

(b) añadir un antígeno a los complejos de anti-anticuerpo/IgG resultantes durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir que dicho antígeno se una al anticuerpo IgG unido, comprendiendo dicho antígeno una mezcla de 1) un polipéptido, en el que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62; y 2) P35;

(c) añadir un conjugado a los complejos de anti-anticuerpo/IgG/antígeno resultantes, comprendiendo dicho conjugado una composición que comprende un anticuerpo monoclonal o policlonal unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable; y

(d) detectar los anticuerpos IgG que puedan estar presentes en dicha muestra de ensayo por detección de una señal generada por dicho compuesto generador de señal.

16. Un método para detectar la presencia de anticuerpos IgM e IgG contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende las etapas de:

a) poner en contacto dicha muestra de ensayo sospechosa de contener dichos anticuerpos IgM e IgG con una composición que comprende 1) un polipéptido, en la que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62, y 2) P35, durante un tiempo y en condiciones suficientes para la formación de complejos de antígeno/anticuerpo IgM y complejos de antígeno/anticuerpo IgG;

b) añadir un conjugado a los complejos de antígeno/anticuerpo IgM y a los complejos de antígeno/anticuerpo IgG resultantes, durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir que dicho conjugado se una al anticuerpo IgM e IgG unido, en el que dicho conjugado comprende un anticuerpo unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable; y

c) detectar la presencia de anticuerpos IgG e IgM que puedan estar presentes en dicha muestra de ensayo por detección de una señal generada por dicho compuesto generador de señal.

17. Un método para detectar la presencia de anticuerpos IgM e IgG contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende las etapas de:

a) poner en contacto dicha muestra de ensayo sospechosa de contener dichos anticuerpos IgM e IgG con un anti-anticuerpo específico para dichos anticuerpos IgM y dichos anticuerpos IgG durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir la formación de complejos de anti-anticuerpo/anticuerpo IgM y complejos de anti-anticuerpo/anticuerpo IgG;

b) añadir un conjugado a los complejos de anti-anticuerpo/anticuerpo IgM resultantes y a los complejos de antianticuerpo/anticuerpo IgG resultantes, durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir que dicho conjugado se una al anticuerpo unido, en el que dicho conjugado comprende una composición que comprende 1) un polipéptido, en el que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62 y 2) P35, cada uno unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable; y

c) detectar los anticuerpos IgM e IgG que puedan estar presentes en dicha muestra de ensayo por detección de una señal generada por dicho compuesto generador de señal.

18. Un método para detectar la presencia de anticuerpos IgM e IgG contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto dicha muestra de ensayo sospechosa de contener anticuerpos IgM e IgG con un antianticuerpo específico para dichos anticuerpos IgM y con un anti-anticuerpo específico para dichos anticuerpos IgG, durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir la formación de complejos de anti-anticuerpo IgM y complejos de anti-anticuerpo/IgG;

(b) añadir un antígeno a los complejos de anti-anticuerpo/IgM resultantes y a los complejos de antianticuerpo/IgG resultantes, durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir que dicho antígeno se una a un anticuerpo IgM unido, comprendiendo dicho antígeno: 1) un polipéptido, en el que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62; y 2) P35; y

(c) añadir un conjugado a los complejos de anti-anticuerpo/IgG/antígeno y a los complejos de anti-anticuerpo/IgG/antígeno resultantes, comprendiendo dicho conjugado una composición que comprende un anticuerpo monoclonal o policlonal unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable; y

(d) detectar los anticuerpos IgM e IgG que puedan estar presentes en dicha muestra de ensayo por detección de una señal generada por dicho compuesto generador de señal.

19. Un kit para determinar la presencia de anticuerpos IgM contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende:

a) una composición que comprende un polipéptido, en la que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62; y

b) un conjugado que comprende un anticuerpo unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable.

20. Un kit para determinar la presencia de anticuerpos IgG contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende:

a) una composición que comprende: 1) un polipéptido, en la que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62; y 2) p35; y

b) un conjugado que comprende un anticuerpo unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable.

21. Un kit para determinar la presencia de anticuerpos IgM contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende:

a) un anti-anticuerpo específico para anticuerpo IgM; y

b) una composición que comprende un polipéptido, en la que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62.

22. Un kit para determinar la presencia de anticuerpos IgM contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende:

a) un anti-anticuerpo específico para anticuerpo IgM; y

b) un conjugado que comprende: 1) una composición que comprende un polipéptido, en la que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62, unido a 2) un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable.

23. Un kit para determinar la presencia de anticuerpos IgG contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende:

a) un anti-anticuerpo específico para anticuerpo IgG; y

b) una composición que comprende: 1) un polipéptido, en la que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62, y 2) P35.

24. Un kit para determinar la presencia de anticuerpos IgG contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende:

a) un anti-anticuerpo específico para anticuerpo IgG; y

b) un conjugado que comprende: 1) un polipéptido, en el que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62 y 2) P35, cada uno unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable.

25. Una vacuna que comprende:

a) al menos un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: 1) un polipéptido, en la que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62, y 2) P35; y b) un adyuvante farmacéuticamente aceptable.

26. Un método de producción de anticuerpos monoclonales contra el polipéptido en la SEC ID Nº: 62, que comprende las etapas de:

a) inyectar a un mamífero no humano un polipéptido, en el que dicho polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62;

b) fusionar esplenocitos de dicho mamífero no humano con células de mieloma para generar hibridomas; y

c) cultivar dichos hibridomas durante un tiempo y en condiciones suficientes para que dichos hibridomas produzcan dichos anticuerpos monoclonales.