ANTICUERPOS DE ISÓTOPOS IGG2 ANTIANTIGENES DE SECRECIÓN-EXCRECIÓN DE PROMASTIGOTE DE LEISHMANIA O AMASTIGOTE.

Inmunoglobulinas de clases IgG2, específicas de antígenos de excreción- secreción de promastigotes o amastigotes de Leishmania sp y capaces de producir la lisis de los amastigotes y promastigotes de Leishmania sp in vitro y de neutralizar su proliferación,

caracterizadas porque son específicas de la parte carboxi terminal del inmunógeno principal excretado-secretado por los promastigotes o los amastigotes de Leishmania sp, pertenecientes a la familia de los Antígenos de Superficie de Proteína y que corresponden a un intervalo de masa molecular de 52 a 58 kDa

La presente invención se refiere a la detección y al uso de anticuerpos de isotipo IgG2 específicos de antígenos de excreción-secreción de Leishmania que permiten:

- poner de manifiesto una inmunidad mediada por células que depende de 5 linfocitos T de tipo Th1,

- seguir la respuesta inmunitaria después de vacunación o tratamiento,

- evaluar la eficacia de un tratamiento quimioterapéutico y/o inmunoterapéutico, en mamíferos y en particular en el hombre, cánidos, félidos y équidos.

- evaluar un estado de resistencia a la leishmaniosis, 10

- establecer una inmunoterapia.

La presente invención se refiere también a:

- poner de manifiesto una respuesta humoral específica representada por las IgG de isotipo IgG2 en el perro y/u otros isotipos en otros mamíferos, respuesta humoral ligada a una respuesta mediada por células dependiente de linfocitos T de 15 tipo Th1.

- detectar esas IgG específicas del parásito Leishmania sp usando antígenos de excreción-secreción (ES) perfectamente definidos y

- la función neutralizante de esas IgG caracterizada por la inhibición de la proliferación de formas amastigotes o promastigotes de Leishmania. 20

El complejo vaccíneo terapéutico constituido por productos de ES en un medio axénico y asérico definido como se describe en la solicitud de patente de invención francesa nº 01/07606 del 11 de junio de 2001, induce una inmunoestimulación del sistema linfocitario de tipo Th1 asegurando la aplicación de una inmunidad protectora. Esta inmunidad de mediación celular que se caracteriza por una activación de 25 linfocitos y de macrófagos y por la síntesis de citocinas específicas de la ruta Th1, está ligada a una inmunidad humoral caracterizada por la producción de IgG específicas neutralizantes de isotipos particulares.

Se pueden dividir de forma muy esquemática las respuestas inmunitarias en dos grandes categorías cualitativamente distintas, las respuestas humorales que 30 implican la producción de anticuerpos por los linfocitos B y las respuestas celulares (reacción de hipersensibilidad retardada, reacciones de citocinas) para las que las células efectoras son los linfocitos T. Parece que en la mayoría de los modelos experimentales y situaciones clínicas estudiadas, las citocinas de origen linfocitario son producidas esencialmente por las células T auxiliares CD4+, cuya función es 35 modular o regular la inmunidad humoral y celular, y que reconocen al antígeno asociado con las moléculas de clase II del complejo mayor de histocompatibilidad. En 1985 surgió un concepto principal cuando T. Mosmann y R. Coffman propusieron que las células linfocitarias T CD4+ expresaban funciones auxiliares que eran de hecho heterogéneas. Así pues, gracias al estudio de clones linfocitarios T CD4+ de ratón, cultivados a largo plazo, estos autores describieron la existencia de dos 5 subpoblaciones principales que se pueden distinguir gracias a su perfil de secreción de citocinas, es decir las células Th1 (para T auxiliares de tipo 1) y las células Th2 (para T auxiliares de tipo 2).

Tomemos, por ejemplo, la leishmaniosis que es una infección parasitaria endémica incluso epidémica de las regiones tropicales y subtropicales del mundo. Los 10 leishmania, protozoos flagelados de la familia de los tripanosomatidos y del género Leishmania, son los agentes patógenos responsables de estas enfermedades.

Los numerosos estudios sobre las respuestas inmunitarias en el transcurso de las leishmaniosis murinas experimentales han conducido a la demostración de la función preponderante de la inmunidad mediada por células y de la existencia de una 15 dualidad de la respuesta inmunológica. Existen fundamentalmente dos tipos de respuestas en contra de las leishmanias: una calificada de “sensibilidad” y la otra de “resistencia”. Por medio de las linfocinas que segregan, las diferentes subpoblaciones de linfocitos T (CD4+) limitan o exacerban la infección. De esta forma se ha demostrado que la subpoblación de linfocitos T auxiliares de tipo Th1 (productora de 20 interferón gamma y de interleucina 2) era capaz de eliminar las formas de amastigotes intracelulares por medio de la activación de macrófagos (Reiner S.L et al., Annu. Rev. Immunol., 1995, 13, 151-177. Revisión). Al contrario, la subpoblación de linfocitos T auxiliares de tipo Th2 (productora de interleucina 4) es responsable de la exacerbación de la enfermedad. 25

En el hombre, estos hechos son de naturaleza comparable. En el perro (huésped natural, “reserva” receptiva del ciclo evolutivo de L. infantum), probablemente existe la dualidad de la respuesta inmunológica. Solamente un estudio llevado a cabo por Pinelli et al. (Infect. Immun., 62 :229, 1994) en animales experimentales e infectados de forma natural por L. infantum, ha permitido mostrar que 30 el estado asintomático del perro (estado clínico que se encuentra con frecuencia) va acompañado de la ausencia de una respuesta humoral y del desarrollo de inmunidad mediada por células de tipo Th1 con una reacción de hipersensibilidad de tipo retardado positivo y de niveles elevados de interleucina 2 y de TNF-α en la circulación en los fluidos biológicos. 35

La polarización de las respuestas inmunitarias hacia un fenotipo Th1 o Th2 se ha asociado a numerosas situaciones patológicas.

Para las infecciones por Leishmania, Trypanosoma, Candida y otros organismos intracelulares como Mycobacterium y Listeria, una respuesta de Th1 se correlaciona con la resistencia al patógeno.

La presente invención consiste principalmente en detectar anticuerpos cuya 5 producción acompaña a la polarización de una inmunidad mediada por células hacia una ruta de tipo Th1.

De acuerdo con los especialistas, tales como Pinelli (Pinelli. E et al. Infect. Immun., 1994, 62:229-235) los perros con leishmaniosis corresponden a la activación del sistema linfocitario de tipo Th2 que presenta una respuesta de anticuerpos 10 elevada. Esta producción de anticuerpos incrementada corresponde a una hiperproteinemia e induce la aparición de inmunocomplejos que conllevan una insuficiencia renal (aumento de la creatina y de la urea en la sangre). Por otra parte, se ha demostrado (RIERA. C et al., vet. parasitology, 1999, 84, 1-2, p33-47) que estos niveles de IgG totales disminuían en los perros experimentales infectados después de 15 tratamiento con glucantime, induciendo este tratamiento solo una recesión temporal de los síntomas, siendo posibles y no previsibles las recaídas .

Sin embargo, algunos trabajos preliminares en el hombre (KAWANO. P et al., Parasite Immunol., 1995, 17, 451-458) y en el perro (NIETO C.G et al., Vet. Immunol. and Immunopathology, 1999, 67, 117-130) anuncian que los isotipos de IgG serían 20 marcadores de la dicotomía inmunitaria Th1/Th2. Además, algunos autores (DEPLAZES. P et al., Parasite Immunology, 1995, 17, p451-458 /RIERA. C et al., vet. parasitology, 1999, 84, 1-2, p33-47) han estudiado con más precisión la importancia de la relación de los isotipos IgG1/IgG2 en el perro con leishmaniosis antes y después de tratamiento. Aunque estas IgG1/IgG2 eran específicas de un antígeno somático total de 25 promastigote, la tasa de IgG2 permanecía constante antes y después de tratamiento, y por el contrario se observó una disminución importante de IgG1 después de tratamiento.

Sin embargo, no se ha establecido nunca la especificidad de estos isotipos para un antígeno o un epítopo perfectamente determinado, ni la función de estos 30 isotipos.

Los perros que han recibido el complejo vaccíneo terapéutico previamente citado descrito en la solicitud de patente de invención francesa nº 01/07606 y por lo tanto protegidos, presentan niveles significativos de IgG2 específicas de proteínas excretadas-secretadas, lo cual está de acuerdo con la expansión preferente de los 35 linfocitos T de tipo Th1. Al contrario, los perros que han recibido un placebo, así como los perros con leishmaniosis, no presentan estas IgG2 específicas.

Los antígenos de excreción-secreción del protozoo Toxoplasma gondii (patente EP 0301961 A) se han estudiado como vacunas y productos terapéuticos, pero estos antígenos no se han correlacionado nunca con las IgG de isotipo particular que tienen una función bien definida. Por otro lado, otros autores (CIBRELUS. P et al., Parasite, 5 1999, 6 n°2, p121-129) han demostrado que los perros infectados de forma natural...

1. Inmunoglobulinas de clases IgG2, específicas de antígenos de excreción-secreción de promastigotes o amastigotes de Leishmania sp y capaces de producir la lisis de los amastigotes y promastigotes de Leishmania sp in vitro y de neutralizar su proliferación, caracterizadas porque son específicas de la parte carboxi terminal del 5 inmunógeno principal excretado-secretado por los promastigotes o los amastigotes de Leishmania sp, pertenecientes a la familia de los Antígenos de Superficie de Proteína y que corresponden a un intervalo de masa molecular de 52 a 58 kDa.

2. Inmunoglobulinas según la reivindicación 1, caracterizadas porque son de 10 isotipos IgG2 en el perro, isotipos ligados a una inmunidad mediada por células dependiente de linfocitos T de tipo Th1.

3. Uso de las inmunoglobulinas según la reivindicación 1 ó 2, como marcador de una inmunidad mediada por células, que permite en particular poner de manifiesto una 15 inmunidad mediada por células dependiente de linfocitos T y preferiblemente de linfocitos T de tipo Th1 en mamíferos.

4. Uso de las inmunoglobulinas según la reivindicación 1 ó 2, como marcadores de resistencia de la leishmaniosis y de infecciones por microorganismos patógenos 20 intracelulares en los mamíferos.

5. Uso de las inmunoglobulinas según la reivindicación 1 ó 2, como marcadores de la vacunación inmunoprofiláctica e inmunoterapéutica en mamíferos, para las leishmaniosis y las infecciones por microorganismos patógenos intracelulares en los 25 mamíferos.

6. Inmunoglobulinas según la reivindicación 1 ó 2, para usar como efectoras de inmunoterapia en el contexto de las leishmaniosis y las infecciones por microorganismos patógenos intracelulares en los mamíferos. 30

7. Uso de las inmunoglobulinas según la reivindicación 1 ó 2, para un producto de diagnóstico in vitro que detecta uno o varios epítopos que llevan los extremos NH2 y COOH de los Antígenos de Superficie de Proteína excretados-secretados de Leishmania sp. 35