Anticuerpos anti-T. cruzi y métodos de uso.

Un reactivo de inmunodiagnóstico que comprende uno o más anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido de T.

cruzi, en donde dicho uno o más anticuerpos son específicos para el polipéptido FP3 de T. cruzi del SEQ ID NO: 2, y en donde dichos uno o más anticuerpos se seleccionan del grupo que consiste en;

(i) un anticuerpo quimérico que tiene una región VH que comprende una secuencia de aminoácidos como la mostrada en el SEQ ID NO: 12 y que tiene una región VL que comprende una secuencia de aminoácidos como la mostrada en el SEQ ID NO: 10;

(ii) el anticuerpo quimérico expresado por la línea celular depositada en la Colección de Tejidos Tipo Americana con el Número de Acceso PTA-8136; y

(iii) el anticuerpo expresado por la línea celular depositada en la Colección de Tejidos Tipo Americana con el Número de Acceso PTA-8139.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2008/088199.

Solicitante: ABBOTT LABORATORIES.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 100 Abbott Park Road Abbott Park, IL 60064-3500 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: SHAH, DINESH, O., TYNER, JOAN D., HAWKSWORTH, DAVID, J., BROPHY,Susan E, TIEMAN,Bryan C, SIEGEL,ROBERT W, TU,BAILIN, ZIEMANN,ROBERT N.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K16/20 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 16/00 Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales. › de protozoos.
  • G01N33/569 SECCION G — FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › para microorganismos, p. ej. protozoarios, bacterias, virus.

PDF original: ES-2539026_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Anticuerpos anti-T cruzi y métodos de uso Campo técnico

La presente descripción se refiere a métodos, análisis y kits para detectar o cuantificar antígenos de Trypanosoma (Schizotrypanum) cruzi.

Antecedentes

El parásito Trypanosoma (Schizotrypanum) cruzi causa la enfermedad de Chagas (tripanosomiasis americana) y es endémica en América Central y del Sur, así como en México. Después de una fase aguda leve, las víctimas más infectadas entran en una fase indeterminada que se caracteriza por una falta de síntomas, bajo recuento de parásitos, y bajos títulos de anticuerpos anti-T. cruzi. Aproximadamente 1-3% de las personas con infecciones crónicas por T. cruzi, desarrollan disfunción cardíaca o gastrointestinal. La quimioterapia puede curar a un número sustancial de bebés y niños infectados congénitamente, pero es en gran medida ineficaz en adultos que albergan infecciones crónicas (Coura, J. y S. de Castro, 22. A critical review on Chagas disease chemotherapy. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 97:3-24). Aproximadamente 25. de los aproximadamente 12 millones de personas en los países endémicos que están infectadas crónicamente con T. cruzi mueren de la enfermedad cada año, debido a alteraciones del ritmo cardíaco o insuficiencia cardíaca congestiva (Kirchhoff, L.V. 26. American trypanosomiasis (Chagas' disease). In Tropical Infections Diseases: Principies, Pathogens and Practice. Vol. R. Guerrant, D. Walker, y P. Weller, editors. Churchill Livingstone, Nueva York. 182-194).

El Chagas recibió el nombre del médico brasileño Carlos Chagas, quien lo describió por primera vez en 199 (Chagas, C. 199A. Neue Trypanosomen. Vorláufige Mitteilung. Arch. Schiff. Tropenhyg. 13: 12-122; Redhead, S. A., et al. 26. Pneumocystis y Trypanosoma cruzi: nomenclature and typifications. J Eukaryot Microbiol. 53: 2-11). Descubrió que los intestinos de Triatomidae albergaban un protozoario flagelado, una nueva especie del género Trypanosoma, y fue capaz de demostrar experimentalmente que el parásito podría transmitirse a los monos tití que eran picados por el insecto infectado. Chagas denominó el parásito patógeno que causa la enfermedad Trypanosoma cruzi (Chagas, 199A) y más tarde ese año Schizotrypanum cruzi (Chagas, C. 199b. Nova tripanozomiase humana: Estudos sobre a morfolojia e o ciclo evolutivo do Schizotrypanum cruzi n. gen., n. sp., ájente etiolojico de nova entidades mórbida do homem. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 1: 159-218), ambos nombres en honor a Oswaldo Cruz, un médico brasileño y epidemiólogo que luchó contra epidemias de fiebre amarilla, viruela y peste bubónica a comienzos del siglo XX.

Charles Darwin pudo haber padecido esta enfermedad como resultado de una mordedura del "Gran Chinche Negro de las Pampas" que recibió al este de los Andes cerca de Mendoza. Darwin informó del episodio en sus diarios de la Viaje del Beagle. Darwin era joven y de buena salud en general, aunque seis meses antes había estado enfermo durante un mes cerca de Valparaíso, pero en 1837, casi un año después de su regreso a Inglaterra, comenzó a sufrir de forma intermitente desde un extraño grupo de síntomas, quedando incapacitado durante gran parte del resto de su vida.

En las zonas endémicas, T. cruzi es transmitido principalmente por insectos triatómidos hematófagos. La enfermedad también se puede transmitir por transfusión de sangre, uso de drogas intravenosas, transmisión congénita, por la actividad sexual, el trasplante de órganos o por medio de la leche materna (Blttencourt, A. L. 1976. Congenital Chagas disease. Am J Dis Child. 13:97-13; Cheng, K.Y., et al.. 27. Immunoblot assay uslng recombinant antigens as a supplemental test to confirm the presence of antibodles to Trypanosoma cruzi. Clin Vaccine Immunol. 14:355-61; Grant, I. H., et al. 1989. Transfusion-associated acute Chagas disease acqulred ¡n the United States. Ann Intern Med. 111:849-51; Hoff, R., et al. 1978. Congenital Chagas's disease ¡n an urban population: investigation of ¡nfected twlns. Trans R Soc Trop Med Hyg. 72:247-5; Kirchhoff, L.V. 1989. Is Trypanosoma cruzi a newthreatto our blood supply? Ann Intern Med. 111:773-5; Skolnlck, A. 1989. Does influx from endemic areas mean more transfusion-associated Chagas' disease? Jama. 262:1433). Actualmente, no existe una vacuna contra T. cruzi.

El diagnóstico de la infección crónica por T. cruzi refleja la complejidad del ciclo de vida del parásito. Durante los períodos de fiebre alta, diagnóstico consiste simplemente en la identificación de los parásitos en la sangre, líquido cefalorraquídeo, tejido fijado o ganglios linfáticos; sin embargo, durante las fases de latencla y crónicas de la Infección, el virus es difícil de detectar. En el xenodiagnóstico, el contenido intestinal de los Insectos vectores se examina para determinar T. cruzi varias semanas después de que estos parásitos se alimenten de la sangre de un paciente sospechoso. Sin embargo, este procedimiento es laborioso, costoso y carece de sensibilidad (Segura, E. 1987. Xenodlagnosls. In Chagas' Disease Vectors. Vol, R.R. Brenner and A. M. Stoka, editors. CRC Press, Boca Ratón, FL. 41-45).

Por el contrario, los análisis serológicos para detectar anticuerpos contra T. cruzi son muy adecuados para el diagnóstico rápido y económico de la infección. Estos métodos incluyen inmunofluorescencia indirecta, hemaglutinación indirecta, fijación del complemento e inmunoanálisis enzimático (Cheng, K.Y., et al. 27, Immunoblot assay using recombinant antigens as a supplemental test to confirm the presence of antibodies to Trypanosoma cruzi. Clin Vaccine Immunol. 14:355-61). Un problema persistente con análisis convencionales ha sido la aparición de resultados no concluyentes y falsos positivos (Almeida, I.C., et al. 1997. A highly sensitive and specific chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of active Trypanosoma cruzi infection. Transfusión. 37:85-7; (Kirchhoff et al., 26; Leiby, D.A., et al. 2. Serologic testing for Trypanosoma cruzi: comparison of radioimmunoprecipitation assay with commercially available indirect immunofluorescence assay, indirect hemagglutination assay, and enzyme-linked immunosorbent assay kits, J Clin Microbiol. 38:639-42).

Ningún análisis ha sido aceptado de manera uniforme como el diagnóstico serológico convencional con oro de la infección por T. cruzi (Cheng et al., 27). Se ha encontrado que los análisis que se han diseñado para detectar ADN de T. cruzi son insensibles (Gomes, M.L., et al. 1999. Chagas' disease diagnosis: comparative analysis of parasitologic, molecular, and serologic methods, Am J Trop Med Hyg. 6:25-1). Un análisis de precipitación radioinmune (RIPA) que produce resultados fácilmente interpretados fue desarrollado hace casi dos décadas y se ha sugerido para su uso como prueba de confirmación en los Estados Unidos (Kirchhoff et al., 1989). Su sensibilidad y especificidad, sin embargo, no se han validado sistemáticamente. Por otra parte, la complejidad del RIPA hace difícil su uso generalizado fuera de los entornos de investigación (Leiby et al., 2).

Quaissi A, et al, Biol.Cell (1992) 75, 11-17 describen un anticuerpo monoclonal reactivo con un antíaeno específico de T. cruzi de 24-kDa aue es una proteína de unión a calcio flagelar indicada como útil en el diagnóstico de la enfermedad de Chaaas.

Los inmunoanálisis diseñados para detectar anticuerpos anti-T. cruzi presentes en muestras de pacientes pueden proporcionar métodos de diagnóstico serológicos rápidos y fiables. Típicamente, este tipo de kits de diagnóstico utilizan uno o más anticuerpos específicos para actuar como calibradores, controles positivos y/o miembros del panel. A menudo, el plasma y/o suero humano con alto título de Chagas se escruta y se incorpora al reactivo de control negativo a cantidades específicas. Los reactivos de control de calidad de Chagas, tales como controles positivos, son muestras de plasma o suero humanos escrutados para detectar la presencia de anticuerpos contra epítopos específicos. Sin embargo, el uso de muestras de suero y plasma humanos tiene varias desventajas significativas. Estas incluyen: (1) el aumento de problemas normativos, (2) la dificultad en la obtención de gran volumen con alto título y especificidad; (3) la variabilidad de los lotes; (4) las limitaciones en cuanto a la caracterización; y (5) el coste.

Por lo tanto, sigue habiendo una necesidad en la técnica de anticuerpos específicos para actuar como calibradores, controles positivos y/o los miembros de panel. La presente descripción opcionalmente supera o evita algunos de los problemas de los inmunoanálisis actuales de T. cruzi (a saber, el aumento de problemas normativos, la dificultad en la obtención de gran volumen con alto título y especificidad,... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un reactivo de inmunodiagnóstico que comprende uno o más anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido de T. cruzi, en donde dicho uno o más anticuerpos son específicos para el polipéptido FP3 de T. cruzi del SEQ ID NO: 2, y en donde dichos uno o más anticuerpos se seleccionan del grupo que consiste en;

(i) un anticuerpo quimérico que tiene una región Vh que comprende una secuencia de aminoácidos como la mostrada en el SEQ ID NO: 12 y que tiene una región Vl que comprende una secuencia de aminoácidos como la mostrada en el SEQ ID NO: 1;

(ii) el anticuerpo quimérico expresado por la línea celular depositada en la Colección de Tejidos Tipo Americana con el Número de Acceso PTA-8136; y

(iii) el anticuerpo expresado por la linea celular depositada en la Colección de Tejidos Tipo Americana con el Número de Acceso PTA-8139.

2. El reactivo de inmunodiagnóstico de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho reactivo de inmunodiagnóstico comprende dos o más de dichos anticuerpos.

3. El reactivo de inmunodiagnóstico de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde dichos uno o más anticuerpos tienen al menos una constante de unión selecciona del grupo que consiste en: una constante de velocidad de asociación (ka) entre 2, x 15 M'V1 y 6, x 1® M"V1; una constante de velocidad de disociación (kd) entre 2, x 1"5s'1 y 8, x 1"4s"1; y una constante de disociación en equilibrio (Kd) entre 3,3 x 1'12 M y 4, x 1"9 M.

4. El reactivo de inmunodiagnóstico de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde dicho reactivo innmunadiagnóstico es un reactivo seleccionado del grupo que consiste en un reactivo de detección, un reactivo de normalización, y un reactivo de control positivo.

5. Un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido FP3 de T cruzi del SEQ ID NO: 2, en donde dicho anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en

(i) un anticuerpo quimérico que tiene una región Vh que comprende una secuencia de aminoácidos como la mostrada en el SEQ ID NO: 12 y que tiene una región VL que comprende una secuencia de aminoácidos como la mostrada en el SEQ ID NO: 1;

(ii) el anticuerpo quimérico expresado por la linea celular depositada en la Colección de Tejidos Tipo Americana con el Número de Acceso PTA-8136; y

(iii) el anticuerpo expresado por la línea celular depositada en la Colección de Tejidos Tipo Americana con el Número de Acceso PTA-8139.

6. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 5, en donde dicho anticuerpo tiene al menos una constante de unión seleccionada del grupo que consiste en: una constante de velocidad de asociación (ka) entre 2, x 15 M'1s'1 y 6, x 1® M'V1; una constante de velocidad de disociación (kd) entre 2, x 1'V y 8, x 1'4s'1; y una constante de disociación en equilibrio (KD) entre 3,3 x 1'12 M y 4, x 1'9 M.

7. Una línea celular que expresa un anticuerpo quimérico que se une específicamente a un polipéptido de T. cruzi, en donde línea celular es una línea celular depositada en la Colección de Tejidos Tipo Americana y que tiene el Número de Acceso PTA-8136.

8. Un método de normalizar un análisis de detección de T. cruzi que comprende utilizar el reactivo de inmunodiagnóstico de acuerdo con la reivindicación 1 como panel de sensibilidad.

9. Un método para detectar un antígeno de T. cruzi que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto una muestra de análisis sospechosa de contener un antígeno de T. cruzi con el reactivo de inmunodiagnóstico de acuerdo con la reivindicación 1 en condiciones que permitan la formación de complejos anticuerpo quimérico:antígeno; y

(b) detectar complejos de anticuerpo quimérico:antígeno cualesquiera formados como una indicación de la presencia de dicho antígeno de T. cruzi.

1. El método de la reivindicación 9, en donde el anticuerpo quimérico comprende una marca detectable, o en donde los complejos de anticuerpo:antígeno se ponen en contacto con un anticuerpo secundario o fragmento del mismo, en donde el anticuerpo secundario o fragmento del mismo comprende un marca detectable.

11. Un método para detectar un anticuerpo de T. cruzi que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto una muestra de análisis sospechosa de contener un anticuerpo de T. cruzi con un antígeno de T. cruzi especifico para el anticuerpo de T. cruzi en condiciones que permiten la formación de complejos de antígeno:anticuerpo; y

(b) detectar complejos de antígeno:anticuerpo cualesquiera formados como una indicación de la presencia de dichos antígenos de T. cruzi,

en donde el reactivo de inmunodiagnóstico de acuerdo con la reivindicación 1 se utiliza en dicho método como control positivo o reactivo de normalización, y en donde el antígeno de T. cruzi es FP3.

12. Un kit de diagnóstico para la detección de T. cruzi que comprende el reactivo de inmunodiagnóstico de la

reivindicación 1.


 

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