Un procedimiento para producir linfocitos B de memoria inmortalizados,

que comprende la etapa de transformarlinfocitos B de memoria usando virus de Epstein Barr (VEB) en presencia de un activador de células B policlonales,en el que el activador de células B policlonales es un agonista de un receptor de reconocimiento de patrones que seexpresa en células B de memoria.

Producción de anticuerpos monoclonales mediante transformación con VEB de células B.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un procedimiento para preparar células B de memoria inmortalizadas y a un procedimiento para preparar células B de memoria inmortalizadas capaces de producir un anticuerpo monoclonal con una especificidad de antígeno deseada. La invención es particularmente útil para preparar anticuerpos monoclonales humanos. En una realización, la invención se refiere a un procedimiento para preparar células B de memoria humanas inmortalizadas capaces de producir anticuerpos específicos para un agente infeccioso, más particularmente donde el agente infeccioso es el virus del síndrome respiratorio agudo severo (SRAS) . A continuación se describe realizaciones adicionales.

Técnica antecedente

El éxito en generar anticuerpos monoclonales murinos depende de la fusión eficaz y selectiva de blastocitos B estimulados con antígeno con una línea celular de mieloma murino seguida de la selección de híbridos estables productores de anticuerpos (Kohler y Milstein 1975) . El documento FR2817875 describe una versión modificada de este protocolo donde antes de la inmortalización, se induce a los linfocitos B a diferenciarse mediante un sistema activador no específico y una citoquina. Los blastocitos B pueden obtenerse del bazo o ganglios linfáticos. Sin embargo, la dificultad en la obtención de blastocitos B estimulados con antígeno y la ausencia de compañeros de fusión adecuados ha impedido este enfoque en el sistema humano.

Como enfoque alternativo a crear anticuerpos humanos, se ha usado el virus de Epstein Barr (VEB) para inmortalizar células B humanas (y de primate) productoras de anticuerpos específicos. El procedimiento de VEB se ha descrito en varias publicaciones desde 1977 (Rosen y col. 1977; Steinitz y col. 1977; Steinitz y col. 1980; Kozbor y Roder 1981; Lundgren y col. 1983; Rosen y col. 1983; Steinitz y col. 1984; Lanzavecchia 1985) . Las células B se inmortalizan por infección con VEB y se seleccionan los clones en cultivo que secretan anticuerpos específicos. El procedimiento no requiere refuerzo antigénico, ya que VEB inmortaliza también células B humanas en reposo. Sin embargo, el procedimiento basado en VEB tiene varias limitaciones, concretamente la baja eficacia de la inmortalización, la baja eficacia de clonación de las células B inmortalizadas con VEB, la baja tasa de crecimiento y, en algunos casos, la baja producción de anticuerpos. El documento US4997764 describe un procedimiento para mejorar la tasa de crecimiento de las células inmortalizadas con VEB que comprende transfectar células B infectadas con VEB con ADN c-myc activado. Esto confiere a las células la capacidad de crecer en medios semisólidos y de crecer en huéspedes tales como ratas y ratones. El documento WO95/13089 describe el uso de GM-CSF e IL-3 para estimular la liberación de anticuerpos por células B. Bornkamm y col. (documento US5798230) han superado el problema de la baja producción de anticuerpos inactivando EBNA2. Sin embargo, esto no resuelve el problema de la baja eficacia de inmortalización. Para sortear estos problemas algunos autores han realizado un enriquecimiento de las células B específicas de antígeno antes de la inmortalización con VEB usando, por ejemplo, antígenos solubles biotinilados (Casali y col. 1986) . Otros propusieron la fusión de células inmortalizadas con VEB con mielomas de ratón o heteromielomas humanos-de ratón para explotar le mayor tasa de crecimiento y secreción de Ig de los híbridos (Kozbor y col. 1982; Bron y col. 1984; Thompson y col. 1986) . Se han hecho reivindicaciones de que la eficacia de clonación podría aumentarse por factores de crecimiento derivados de células tales como tiorredoxina en una publicación (Ifversen y col. 1993) , pero estos resultados ni se han confirmado ni se han utilizado, incluso por los mismos autores. En conclusión, aunque el procedimiento de VEB tiene, en principio, algunas ventajas, se ha abandonado a causa de la baja eficacia de inmortalización y clonación.

Otra razón por la cual el procedimiento de VEB se ha quedado obsoleto es que han llegado a estar disponibles enfoques alternativos para crear anticuerpos monoclonales humanos o tipo humano a través de ingeniería genética. Éstos incluyen la humanización de anticuerpos murinos, el aislamiento de anticuerpos a partir de bibliotecas de diferente complejidad y la producción de hibridomas usando el procedimiento clásico en ratones transgénicos para el loci de Ig humana (el "xeno-ratón") . La bibliografía sobre estos enfoques alternativos no se revisa aquí ya que no es directamente relevante para la presente invención. Sin embargo, merece la pena considerar algunas limitaciones de estos procedimientos. La humanización de anticuerpos monoclonales murinos es un procedimiento laborioso e incompleto. Las bibliotecas de anticuerpos aleatorios representan un repertorio no sesgado y por lo tanto pueden usarse para seleccionar especificidades de anticuerpos contra antígenos altamente conservados, pero conducen a anticuerpos de baja afinidad. Las bibliotecas seleccionadas a partir de células sensibilizadas con antígeno se enriquecen para una especificidad particular, pero no conservar el par VH-VL original y generalmente conducen a anticuerpos que tienen menor afinidad por el antígeno que aquellos presentes en el repertorio original de anticuerpos. El impacto de esta tecnología ha sido limitado. En contraste, el xeno-ratón puede inmunizarse de forma eficaz contra un antígeno de elección (especialmente si éste es un antígeno humano) , pero este sistema comparte con la tecnología clásica del hibridoma murino la limitación de que los anticuerpos se seleccionan en una especia diferente a la humana. Por lo tanto, estos procedimientos no son adecuados para producir anticuerpos con las características de los producidos en el transcurso de una respuesta inmune humana fisiológica. Esto es aplicable a la respuesta de anticuerpos contra patógenos humanos incluyendo VIH, las cuatro especies de Plasmodium que cusan la malaria en seres humanos (P. falciparum, P. vivax, P. malariae y P. ovale) , los virus de la hepatitis B y C

humana, el virus del sarampión, virus del Ébola etc. (para una lista exhaustiva véase Fields y col. 1996) . También es aplicable a respuestas de anticuerpos contra alérgenos ambientales generados en pacientes alérgicos, contra antígenos tumorales generados en pacientes que albergan tumores y contra auto-antígenos en pacientes con enfermedades autoinmunes.

Por lo tanto, existe la necesidad de un procedimiento de producción eficaz de anticuerpos monoclonales humanos que se hayan seleccionado en el transcurso de la respuesta inmune natural.

Divulgación de la invención

Aunque la presente invención se ilustra mediante realizaciones en las que se producen anticuerpos monoclonales humanos, las técnicas descritas en este documento no están limitadas de tal modo. La presente invención puede usarse para cualquier especie para la que se desee producir anticuerpos monoclonales de forma eficaz.

La invención se basa en el descubrimiento de que un activador de células B policlonales (tal como secuencias CpG) potencia la eficacia de la inmortalización por VEB y de la clonación de células inmortalizadas por VEB. Esta eficacia aumentada representa un gran salto que hace que la técnica de VEB sea adecuada para el rápido aislamiento de grandes cantidades de anticuerpos monoclonales humanos a partir del repertorio de memoria sin necesidad de inmunización específica o iniciación. Los anticuerpos se seleccionan del entorno inmunocompetente fisiológico estimulado por contacto natural con un patógeno o antígeno. El procedimiento, por lo tanto, es particularmente útil para producir anticuerpos contra determinantes antigénicos que se reconocen específicamente por el sistema inmune humano. Éstos incluyen anticuerpos neutralizantes contra patógenos humanos y anticuerpos contra alérgenos, anticuerpos tumorales, auto-antígenos y alo-antígenos que son parte del repertorio de memoria de un individuo dado. Por lo tanto, no hay necesidad de crear modelos de enfermedad o de inmunización con antígenos purificados. Los anticuerpos producidos también son completamente humanos (incluyendo modificaciones nativas post-traduccionales cuando se expresan en células B) y exploran toda la diversidad generada en el transcurso de una respuesta inmune humana (maduración de afinidad) . Por tanto, la invención proporciona, inter alia, un procedimiento... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para producir linfocitos B de memoria inmortalizados, que comprende la etapa de transformar linfocitos B de memoria usando virus de Epstein Barr (VEB) en presencia de un activador de células B policlonales, en el que el activador de células B policlonales es un agonista de un receptor de reconocimiento de patrones que se expresa en células B de memoria.

2. Un procedimiento para producir un clon de un linfocito B de memoria humano inmortalizado capaz de producir un anticuerpo monoclonal humano con una especificidad de antígeno deseada, que comprende las etapas de: (i) transformar una población de células que comprende o que consta de linfocitos B de memoria humanos con virus de Epstein Barr (VEB) en presencia de un activador de células B policlonales, en el que el activador de células B policlonales es un agonista de un receptor de reconocimiento de patrones que se expresa en células B de memoria;

(ii) explorar el sobrenadante de cultivo para la especificidad de antígeno; y (iii) aislar un clon de linfocito B de memoria humano inmortalizado capaz de producir un anticuerpo monoclonal humano que tenga la especificidad de antígeno deseada.

3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que el activador de células B policlonales es un agonista de un receptor tipo Toll.

4. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que el activador de células B policlonales es un agonista del receptor tipo Toll-7 (TLR-7) , receptor tipo Toll-9 (TLR-9) y/o receptor tipo Toll-10 (TLR-10) .

5. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que el activador de células B policlonales se selecciona entre el grupo que consiste en: oligodesoxinucleótidos CpG; R-848 y otros compuestos de imidazoquinolina que estimulan los TLR; imiquimod; loxoribina; 7-tia-8-oxoguanosina; 7-desazaguanosina; y anticuerpos monoclonales que imitan los efectos de estos activadores.

6. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que el activador de células B policlonales es CpG 2006.

7. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que se añade un estimulador adicional del crecimiento y/o diferenciación celular durante la etapa de transformación.

8. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicho estimulador adicional es una citoquina.

9. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que dicha citoquina es IL-2 o IL-15.

10. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la clonación se realiza usando dilución limitante.

11. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que se selecciona una subpoblación de linfocitos B de memoria humanos con una especificidad de antígeno específica antes de la etapa de transformación.

12. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que dicho linfocito B de memoria produce un anticuerpo dirigido contra patógenos humanos tales como el virus del SRAS, el virus de la inmunodeficiencia humana; el virus de la hepatitis A; el virus de la hepatitis B; el virus de la hepatitis C; el virus del herpes simple tipo 1 o tipo 2; el virus del sarampión; el virus de las paperas; el virus de la rubéola; el virus de la rabia; el virus del Ébola; el virus de la influenza; el virus del papiloma; el virus vaccinia; el virus de varicela-zóster; virus de la viruela; virus de la polio; el rinovirus; el virus sincitial respiratorio; P. falciparum; P. vivax; P. malariae; P. ovale; Cor y nebacterium diphtheriae; Clostridium tetani; Clostridium botulinum; Bordetella pertussis; Haemophilus influenzae; Neisseria meningitidis, serogrupo A, B, C, W135 y/o Y; Streptococcus pneumoniae; Streptococcus agalactiae; Streptococcus pyogenes; Staphylococcus aureus; Bacillus antracis; Moraxella catarrhalis; Chlaymdia trachomatis; Chlamydia pneumoniae; Yersinia pestis; Francisella tularensis; especies de Salmonella; Vibrio cholerae;

E. coli tóxica; un retrovirus endógeno humano; otros patógenos microbianos; otras toxinas microbianas, alérgenos, antígenos tumorales, autoantígenos y aloantígenos, agentes químicos o toxinas.

13. Un procedimiento para producir un anticuerpo monoclonal humano que comprende preparar un linfocito B de memoria humano inmortalizado por un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2-12, cultivar dicho linfocito B de memoria humano inmortalizado y aislar el anticuerpo monoclonal humano.

14. Un procedimiento para producir un anticuerpo monoclonal humano que comprende las etapas de: (i) preparar un linfocito B de memoria humano inmortalizado por un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12; (ii) obtener el ácido nucleico del linfocito B de memoria inmortalizado; (iii) insertar el ácido nucleico en un huésped de expresión para permitir la expresión del anticuerpo en este huésped.

15. El procedimiento de la reivindicación 13 o la reivindicación 14, que comprende adicionalmente la etapa de mezclar el anticuerpo monoclonal aislado con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

16. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que los linfocitos B de memoria no se fusionan con otras células.

17. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que el linfocito B de memoria es un linfocito B de memoria humano.

18. Un procedimiento para preparar una célula recombinante, que comprende las etapas de: (i) preparar un clon de célula B inmortalizada por el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12; (ii) obtener el ácido nucleico del clon de célula B que codifica un anticuerpo de interés; y (iii) insertar el ácido nucleico en un huésped de expresión para permitir la expresión del anticuerpo de interés en ese huésped.

19. Un procedimiento para preparar una célula recombinante, que comprende las etapas de: (i) preparar un clon de célula B inmortalizada por el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12; (ii) secuenciar el ácido nucleico del clon de célula B que codifica un anticuerpo de interés; y (iii) usar la información se secuencia de la etapa (ii) para preparar el ácido nucleico para insertarlo en un huésped de expresión para permitir la expresión del anticuerpo de interés en ese huésped.

20. El procedimiento de la reivindicación 18 o reivindicación 19, en el que el huésped de expresión es una célula de levadura, una célula vegetal o una célula animal.

21. Un procedimiento para preparar una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo de interés, que comprende las etapas de: (i) preparar un clon de célula B inmortalizada por el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12; (ii) obtener del clon de célula B el ácido nucleico que codifica el anticuerpo de interés.

22. Un procedimiento para obtener una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo de interés, que comprende las etapas de: (i) preparar un clon de célula B inmortalizada por el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12; (ii) secuenciar el ácido nucleico del clon de célula B que codifica el anticuerpo de interés.

23. Un procedimiento para preparar un anticuerpo para uso farmacéutico, que comprende las etapas de: (i) preparar una célula B inmortalizada que produce un anticuerpo de interés por el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12; (ii) obtener y/o secuenciar el ácido nucleico que codifica el anticuerpo de interés a partir de la célula B seleccionada; (iii) insertar el ácido nucleico en o usar el ácido nucleico para preparar un huésped de expresión que pueda expresar el anticuerpo de interés; (iv) cultivar o subcultivar el huésped de expresión en condiciones en que se exprese el anticuerpo de interés; y, opcionalmente, (v) purificar el anticuerpo de interés.

24. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 18, 19 ó 23, en el que el ácido nucleico se manipula entre las etapas (ii) y (iii) para introducir sitios de restricción, para cambiar el uso de codones, y/o para añadir u optimizar secuencias reguladoras de la transcripción y/o la traducción.

25. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13, 14 ó 23, en el que el anticuerpo está dirigido contra el virus sincitial respiratorio (VSR) .