Un anticuerpo específico para una proteína tau del sistema nervioso central (SNC),

donde el anticuerpo reconoce específicamente una proteína tau del SNC pero no una proteína tau periférica y donde el anticuerpo reconoce específicamente una secuencia de aminoácidos de una parte de conexión entre la secuencia de aminoácidos codificada por el Exón 4 de un gen que codifica una proteína tau y la secuencia de aminoácidos codificada por el Exón 5 del mismo como un epítopo

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere a un anticuerpo que reconoce específicamente la proteína tau del sistema nervioso central (proteína tau del SNC) pero no la proteína tau de tejidos periféricos (proteína tau periférica). Adicionalmente, la presente invención se refiere a un método de detección de tauopatía en el que se analiza la presencia de la proteína tau del SNC en una muestra, particularmente a un método de detección de la enfermedad de Alzheimer y también a un kit de reactivos.

TÉCNICA ANTECEDENTE

La enfermedad de Alzheimer es una demencia progresiva que se produce en la etapa presenil (entre los 45 y 65 años). Produce cambios mórbidos tales como degeneración neuronal y atrofia del córtex cerebral debido a la disminución del número de neuronas. Patológicamente, se observan varias placas seniles y degeneración neurofibrilar en el cerebro. La denominada demencia senil causada por envejecimiento espontáneo en la senectud a una edad de 65 años o más no difiere sustancialmente de la enfermedad de Alzheimer desde el punto de vista patológico y se considera una demencia senil de tipo Alzheimer. Esta enfermedad se ha percibido como un problema social porque el número de pacientes que padecen la enfermedad de Alzheimer aumenta a medida que aumenta la población senil. Aunque existen diversas hipótesis acerca de las causas de esta enfermedad, aún no se han esclarecido y se desea un rápido avance en la aclaración de la enfermedad.

Se sabe que el principal componente de las placas seniles que es uno de los cambios patológicos causados por la enfermedad de Alzheimer es la proteína  amiloide (Annu. Rev, Neurosci., 12, 463-490 (1989)). La degeneración neurofibrilar, que es otro cambio patológico, muestra acumulación del filamento pareado helicoidal (que puede denominarse en lo sucesivo en este documento PHF) en las neuronas y la proteína tau fosforilada se identifica como uno de sus constituyentes

(J. Biochem. 99, 1807-1810 (1986); Proc. Natl. Sci. USA, 83, 4913-4917 (1986)).

Aunque la proteína tau está compuesta de un grupo de isoformas de proteínas que normalmente forman varias bandas con un peso molecular de 48 a 65 kD como resultado de la electroforesis en gel de poliacrilamida/SDS y promueve la formación de microtúbulos, se ha demostrado que la proteína tau incorporada en el PHF del cerebro con enfermedad de Alzheimer se encuentra anormalmente fosforilada en comparación con la del cerebro normal usando un anticuerpo policlonal contra PHF (anti-p-tau; J. Biochem., 99, 1807-1810 (1986)) y un anticuerpo monoclonal contra la proteína tau (anticuerpo de tau-1; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 4913-4917 (1986)). Además, se han identificado los sitios de fosforilación de la proteína tau fosforilada incorporada en el PHF (documento JP 6239893 A); y actualmente se están clarificando las funciones de la proteína tau implicadas en la enfermedad de Alzheimer.

Para las proteínas tau, se encuentra actualmente disponible en el mercado un kit para la medición de la concentración de una proteína tau en el líquido cefalorraquídeo (nombre comercial en Japón “Finoscolor hTAU” y nombre comercial en los Estados Unidos y Europa “INNOTEST hTAU Ag”, fabricado por Innogenetics) y se utiliza clínicamente. Por otro lado, se ha desarrollado un método de detección de la enfermedad de Alzheimer basado en el sitio de fosforilación de una proteína tau fosforilada en PHF (Neurosci. Lett., 270, 91-94 (1999); Ann. Neurol., 50, 150156 (2001)). Estos dos métodos están diseñados para usar como muestra líquido cefalorraquídeo. La extracción de las muestras presenta problemas debido a su gran invasividad en los pacientes. Por lo tanto, para reducir la invasividad en los pacientes y realizar un análisis conveniente, ha existido una fuerte demanda de métodos específicos y sensibles de detección de la enfermedad de Alzheimer con los que pueda analizarse una proteína tau del SNC incluso usando una diversidad de muestras no limitadas al líquido cefalorraquídeo y que incluyen la sangre.

Sin embargo, se ha puesto de manifiesto que se han descubierto varias formas diferentes para la proteína tau, y un tejido nervioso central tal como el cerebro y un tejido periférico tal como el músculo son diferentes en las isoformas de la proteína tau que existen predominantemente en cada tejido (J. Neurochem., 67, 1235-1244 (1996). Por ejemplo, la isoforma de una proteína tau que existe predominantemente en un tejido periférico (que también se denomina en lo sucesivo en este documento “proteína tau periférica”) tiene un gran peso molecular en comparación con la isoforma de una proteína tau que existe predominantemente en un tejido nervioso central (que también se denomina en lo sucesivo en este documento “proteína tau del SNC”). Se ha sugerido que, en una muestra de sangre

o similar, esta proteína tau periférica que tiene un gran peso molecular está incluida en una gran cantidad.

Los inventores de la presente invención han propuesto previamente un método para la detección de la enfermedad de Alzheimer usando sangre como muestra (documento JP 2002-040023 A). Sin embargo, este método es un método en el que no se distinguen isoformas en la proteína tau y se detecta la cantidad total de la misma. Por consiguiente, el método no permite analizar específicamente un cambio en la proteína tau del SNC que se produce en el cerebro de un paciente con enfermedad de Alzheimer. Por ejemplo, cuando se analiza una muestra de sangre o similar usando dicho método, la detección de una proteína tau del SNC se ve afectada por la fuerte reacción de una proteína tau periférica que tiene un gran peso molecular que está contenida en una gran cantidad en la muestra de sangre. Como resultado, no se obtiene suficiente sensibilidad.

Mercken M et al. (Acta Neuropathologica, Springer Verlag, Berlin, DE, vol. 84, nº 3, 1992, páginas 265-272) se dirigen a anticuerpos monoclonales con especificidad selectiva para la proteína Tau de la enfermedad de Alzheimer dirigidos contra epítopos sensibles a fosfatasa. Tranchant C. (M/S Medecine Sciences, Societe des Periodiques Flammarion, París, FR, vol. 13, nº 8/9, Agosto de 1997, páginas 989-997) se dirigen a proteínas Tau y enfermedades neurodegenerativas. El documento WO 96/04309 se dirige a anticuerpos monoclonales específicos para un epítopo de una subclase particular o forma de hibridomas de tau fosforilada que los secretan, al reconocimiento de antígeno de estos anticuerpos y a sus aplicaciones.

Resumiendo, ha sido difícil analizar una proteína tau procedente de un tejido del sistema nervioso central cuyo contenido es bajo en una muestra de sangre o similar que tiene concentraciones extremadamente elevadas de proteínas en bruto y una gran interferencia debida a impurezas (Dement, Geriat. Cong. Disord., 10, 442-445 (1999); Neurosci. Lett., 275, 159-162 (1999), y no se ha realizado el establecimiento de métodos específicos y sensibles para detectar la enfermedad de Alzheimer.

Adicionalmente, el deterioro cognitivo leve (que puede abreviarse en lo sucesivo en este documento como “MCI”), que muestra un síntoma subjetivo de pérdida de memoria o similar, ha recibido recientemente atención como pródromo de la enfermedad de Alzheimer. Se ha dicho que pacientes diagnosticados que tienen MCI, el 10-15% en un año y el 50% en varios años, desarrollan la enfermedad de Alzheimer, y cada vez hay más aceptación de que los pacientes con enfermedad de Alzheimer temprana se incluyen en los pacientes con MCI. Sin embargo, la evaluación existente para el MCI satisface un criterio tal como los criterios de Petersen, R. C. et al., (Arch. Neurol., 56, 303-308 (1999)) que se centran en tomar historias o en exámenes de función inteligente. Por lo tanto, no se han establecido diagnósticos objetivos y claros. Adicionalmente, con estos métodos convencionales, no es posible detectar pacientes con enfermedad de Alzheimer temprana entre un grupo de pacientes diagnosticados que tienen MIC. Por consiguiente, se ha pedido encarecidamente, el establecimiento de métodos para detectar claramente la enfermedad de Alzheimer para pacientes que incluyen dichos pacientes.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se ha realizado para proporcionar un método muy específico, sensible y conveniente para detectar la enfermedad de Alzheimer.

Los inventores de la presente invención se han dedicado a extensos estudios para conseguir el objetivo anterior y han descubierto que la detección de la enfermedad...

1. Un anticuerpo específico para una proteína tau del sistema nervioso central (SNC), donde el anticuerpo reconoce específicamente una proteína tau del SNC pero no una proteína tau periférica y donde el anticuerpo reconoce específicamente una secuencia de aminoácidos de una parte de conexión entre la secuencia de aminoácidos codificada por el Exón 4 de un gen que codifica una proteína tau y la secuencia de aminoácidos codificada por el Exón 5 del mismo como un epítopo.

2. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha parte de conexión es una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos número 121-128 de una secuencia de aminoácidos descrita en la SEC ID Nº: 1 de la lista de secuencias.

3. Un método para producir un anticuerpo específico para una proteína tau del SNC, que comprende: inmunizar a un animal con un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos específica para una proteína tau del SNC como antígeno;

analizar la reactividad del anticuerpo resultante con una proteína tau del SNC y una proteína tau periférica; y seleccionar un anticuerpo que tenga reactividad específica para la proteína tau del SNC y que tenga reactividad específica para una secuencia de aminoácidos de una parte de conexión entre la secuencia de aminoácidos codificada por el Exón 4 de un gen que codifica una proteína tau y la secuencia de aminoácidos codificada por el Exón 5 del mismo como epítopo, donde la secuencia de aminoácidos específica para la proteína tau del SNC comprende una secuencia que contiene una secuencia de aminoácidos de una parte de conexión entre la secuencia de aminoácidos codificada por el Exón 4 de un gen que codifica una proteína tau y la secuencia de aminoácidos codificada por el Exón 5 del mismo.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicha parte de conexión es una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos número 121-128 de una secuencia de aminoácidos descrita en la SEC ID Nº: 1 de la lista de secuencias.

5. Un método para detectar tauopatías, que comprende analizar la presencia de una proteína tau del SNC en una muestra obtenida de un individuo que se sospecha que tiene tauopatía, usando el anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la tauopatía es la enfermedad de Alzheimer.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6, en el que la muestra se ha tratado por desnaturalización en presencia de un agente de solubilización de proteínas para retirar las proteínas concomitantes.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la muestra se ha tratado adicionalmente por condensación.

9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en el que la muestra es sangre.

10. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en el que el análisis de la presencia de la proteína tau del SNC se realiza mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima.

11. Un kit de reactivos para la detección de la enfermedad de Alzheimer, que comprende al menos el anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2.