PROCEDIMIENTO PARA ANALIZAR INMUNOLÓGICAMENTE EL PRODUCTO DE LA DEGRADACIÓN CON PLASMINA DE LA FIBRINA ESTABILIZADA.

Procedimiento para analizar inmunológicamente el producto de la degradación con plasmina de la fibrina estabilizada Campo técnico La presente invención se refiere a un procedimiento para analizar inmunológicamente los productos digeridos con plasmina de la fibrina estabilizada, en particular un ensayo muy sensible para los productos digeridos con plasmina de la fibrina estabilizada mediante quimioluminiscencia. El término análisis, tal como se emplea en la presente, incluye la detección para determinar la presencia o la ausencia de una sustancia que se va a analizar, y la medición para determinar cuantitativa o semicuantitativamente una cantidad o una actividad de una sustancia que se va a analizar. Antecedentes de la técnica ES 2 366 043 T3 Los productos digeridos de la fibrina estabilizada humana con diversas proteasas son útiles como marcadores de diagnóstico en la diagnosis clínica. Por ejemplo, los productos digeridos con plasmina de la fibrina estabilizada humana, que incluyen p-DD/E como unidad básica, y sus polímeros u oligómeros (denominados en lo sucesivo a veces en la presente dímero D-D o complejo DD/E), tienen un uso extendido como marcadores de diagnóstico de la coagulación intravascular diseminada (DIC). En la determinación de los productos digeridos con plasmina de la fibrina estabilizada en una muestra biológica, en general se emplea una aglutinación de látex sensibilizado con un anticuerpo monoclonal específico para los productos digeridos con plasmina de la fibrina estabilizada. Es necesario en la actualidad prestar atención a la trombosis de venas profundas (DVT). En Japón, la DVT no tiene una fuerte incidencia pero el número de pacientes que la sufren está aumentando a medida que el estilo de vida japonés se va occidentalizando. Un diagnóstico o una predicción de la trombosis, o la presencia de trombos, es muy difícil, pero los productos digeridos con plasmina de la fibrina estabilizada son el marcador más fiable para un diagnóstico de DVT (referencias que no son patentes 1 y 2). La fibrina estabilizada, que se genera mediante la reticulación de la fibrina durante el proceso de la coagulación, se digiere con plasmina para producir polímeros u oligómeros p-DD/E compuestos de una unidad básica de p-DD/E, o p-DD/E. Por tanto, la formación de trombos y la fibrinolisis secundaria puede controlarse detectando p-DD/E o sus polímeros u oligómeros. La medición de los productos digeridos con plasmina de la fibrina estabilizada es muy útil para confirmar la presencia de trombos. La embolia pulmonar (PE), conocida como el síndrome de la clase turista, he empezado a destacar. Se considera que la PE se desarrolla debido al bloqueo del flujo sanguíneo con trombos de venas profundas que viajan a través de la vena cava inferior y corazón hasta alcanzar una arteria pulmonar. Existe un informe que indica que la medición de los productos digeridos con plasmina de la fibrina estabilizada es útil para evaluar pacientes que padecen PE, así como los que padecen DVT (referencias que no son patentes 3 y 4). Se conoce el anticuerpo monoclonal JIF-23 por ser un anticuerpo monoclonal capaz de detectar de modo específico los productos digeridos con plasmina de la fibrina estabilizada (referencia que no es una patente 5). Se sabe que este anticuerpo reconoce la estructura N-terminal recién expuesta en el dominio D1 después de liberar la secuencia N-terminal, que consiste en los aminoácidos 63-85 de la cadena del dominio D1A en los productos digeridos con plasmina de la fibrina estabilizada. La formación de trombos y la fibrinolisis secundaria pueden controlarse con facilidad mediante un procedimiento de medición capaz de analizar de modo específico los productos digeridos con plasmina de la fibrina estabilizada contenidos en una muestra biológica, utilizando el anticuerpo JIF-23. Este procedimiento de medición no está particularmente limitado pero puede ser, por ejemplo, un procedimiento de aglutinación de látex o un procedimiento ELISA. El procedimiento de aglutinación de látex es conocido en el campo clínico por ser un procedimiento convencional de uso habitual para medir los productos digeridos con plasmina de la fibrina estabilizada utilizando el anticuerpo JIF- 23. La cantidad de productos digeridos con plasmina de la fibrina estabilizada es de 0,4 µg/ml FEU en personas sanas, según la referencia que no es una patente 6, y de 15,2 ± 18,5 µg/ml en pacientes que padecen DIC, según la referencia que no es una patente 7. Los productos digeridos con plasmina de la fibrina estabilizada pueden detectarse con la reacción de aglutinación de látex utilizando el anticuerpo JIF-23 (sensibilidad de la detección = aproximadamente 45 ng/ml) y, de hecho, este procedimiento se emplea habitualmente en el campo clínico. El valor de corte clínico para la DVT es de 0,5 µg/ml FEU, según la referencia que no es una patente 8. El diagnóstico de la DVT requiere controlar los pequeños cambios entre los valores para personas normales y para pacientes en comparación con el diagnóstico de DIC y, por tanto, se desea un procedimiento de medición más sensible capaz de ensayar de modo preciso los productos digeridos con plasmina de la fibrina estabilizada en el intervalo normal. Como procedimiento ELISA que emplea un anticuerpo que reconoce un neoantígeno en el dominio D de los 2 productos digeridos de la fibrina estabilizada se conoce, por ejemplo, MiniVidas (Biomerieux) (referencias que no son patentes 8 y 11). En la referencia que no es una patente 9 se indica que la sensibilidad en un procedimiento ELISA es mayor que en una aglutinación de látex y, por tanto, el procedimiento ELISA es útil para el diagnóstico de la DVT. Este procedimiento ELISA con una alta sensibilidad se está extendiendo al campo clínico como un procedimiento para medir los productos digeridos con plasmina de la fibrina estabilizada. Por ejemplo, la sensibilidad de detección del MiniVidas es de aproximadamente 45 ng/ml FEU. Los valores y las unidades descritas anteriormente se basan en las descripciones de las referencias que no son patentes, y las unidades µg/ml FEU y µg/ml pueden interconvertirse según la siguiente ecuación: 1 µg/ml = 2 µg/ml FEU en la que el valor 2 es un valor aproximado (referencia que no es una patente 10). Referencia que no es una patente 1: Thrombosis and Haemostasis, Alemania, 1994, vol. 71, pp. 1-6. Referencia que no es una patente 2: Quality Journal of Medicine, Reino Unido, 1997, vol. 90, pp. 437-442. Referencia que no es una patente 3: Thrombosis and Haemostasis, Alemania, 1999, vol. 81, pp. 493-497. Referencia que no es una patente 4: Thrombosis and Haemostasis, Alemania, 2000, vol. 83, pp. 191-198. Referencia que no es una patente 5: Excepta Medica, Amsterdam, Países Bajos, 1990, pp. 43-48. Referencia que no es una patente 6: U.K. National External Quality Assessment Scheme for Blood Coagulation, informe sobre el estudio 142, Reino Unido, mayo de 2004. Referencia que no es una patente 7: ANNALES DE BIOLOGIE CLINIQUE, Francia, 1988, vol. 46, pp. 730-733. Referencia que no es una patente 8: Biomerieux Vidas D-Dimer Package Insert, EEUU, septiembre de 2003, 008120-4. Referencia que no es una patente 9: Annals of Internal Medicine, EEUU, 2004, pp. 589-602. Referencia que no es una patente 10: Journal of Thrombosis and Heamostasis, Reino Unido, 2005, pp. 377-384. Referencia que no es una patente 11: British Journal of Haematology, Reino Unido, 2004, pp. 15-25. En Pfitzner et al. (1997), Thrombosis and Haemostasis, vol. 78, pp. 1069-1078, se describen combinaciones de anticuerpos monoclonales para la investigación de los productos de la degradación de la fibrina. Por ejemplo, el anticuerpo JIF-23 se emplea en combinación con otros anticuerpos pero ninguno de los cuales se une a un neoantígeno en el dominio E de la fibrina estabilizada digerida con plasmina. Descripción de la invención Problemas que resuelve la invención Un objeto de la presente invención es proporcionar un ensayo más sensible para los productos digeridos con plasmina de la fibrina estabilizada. Este ensayo, con una sensibilidad mayor que los ensayos muy sensibles convencionales, permite una reducción en el tiempo de medición. Medios para resolver los problemas ES 2 366 043 T3 El objeto puede resolverse mediante la presente invención, es decir, un procedimiento para analizar inmunológicamente los productos digeridos con plasmina de la fibrina estabilizada, que se caracteriza por utilizar una combinación de: (a) un anticuerpo monoclonal que no reacciona con la fibrina estabilizada, con el fibrinógeno ni con los productos digeridos con plasmina del fibrinógeno, pero sí reacciona con un neoantígeno recién expuesto en el dominio D por la digestión con plasmina de la fibrina estabilizada, y (b) un anticuerpo monoclonal que reconoce un sitio diferente al reconocido por el anticuerpo monoclonal... [Seguir leyendo]

1.- Un procedimiento para analizar inmunológicamente los productos digeridos con plasmina de la fibrina estabilizada, que se caracteriza porque emplea una combinación de: (a) un anticuerpo monoclonal (a) que no reacciona con la fibrina estabilizada, con el fibrinógeno ni con los productos digeridos con plasmina del fibrinógeno, pero sí reacciona con un neoantígeno recién expuesto en el dominio D por la digestión con plasmina de la fibrina estabilizada, y (b) un anticuerpo monoclonal (b) que reconoce un sitio diferente al reconocido por el anticuerpo monoclonal (a), y que reacciona de modo específico con los productos digeridos con plasmina de la fibrina estabilizada, en el que el anticuerpo monoclonal (b) no reacciona con la fibrina estabilizada, con el fibrinógeno ni con los productos digeridos con plasmina del fibrinógeno, pero sí reacciona con un neoantígeno recién expuesto en el dominio E por la digestión con plasmina de la fibrina estabilizada, en el que uno de los anticuerpos monoclonales (a) y (b) es portado por una partícula magnética, y el otro está marcado con una enzima, y se emplea un sustrato quimioluminiscente como sustrato para la enzima. 2.- El procedimiento según la reivindicación 1, que comprende: (1) poner en contacto una muestra sospechosa de contener los productos digeridos con plasmina de la fibrina estabilizada con los anticuerpos monoclonales (a) y (b); (2) separar un anticuerpo monoclonal marcado con una enzima que forma un inmunocomplejo, a través de los productos digeridos con plasmina de la fibrina estabilizada, siendo portado el anticuerpo monoclonal por una partícula magnética, de un anticuerpo monoclonal marcado con una enzima que no forma el inmunocomplejo; (3) añadir un sustrato quimioluminiscente al inmunocomplejo separado del anticuerpo monoclonal portado por una partícula magnética/productos digeridos con plasmina de la fibrina estabilizada/anticuerpo monoclonal marcado con una enzima, para provocar la emisión de luz quimioluminiscente; y (4) analizar la señal quimioluminiscente generada. 3.- El procedimiento según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el sustrato quimioluminiscente es 1,2-dioxetano. 4.- El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la enzima marcadora es la fosfatasa alcalina. 5.- Un kit para analizar inmunólogicamente los productos digeridos con plasmina de la fibrina estabilizada, que se caracteriza porque comprende: (a) un anticuerpo monoclonal (a) que no reacciona con la fibrina estabilizada, con el fibrinógeno ni con los productos digeridos con plasmina del fibrinógeno, pero sí reacciona con un neoantígeno recién expuesto en el dominio D por la digestión con plasmina de la fibrina estabilizada, y (b) un anticuerpo monoclonal (b) que reconoce un sitio diferente al reconocido por el anticuerpo monoclonal (a), y que reacciona de modo específico con los productos digeridos con plasmina de la fibrina estabilizada, en el que el anticuerpo monoclonal (b) no reacciona con la fibrina estabilizada, con el fibrinógeno ni con los productos digeridos con plasmina del fibrinógeno, pero sí reacciona con un neoantígeno recién expuesto en el dominio E por la digestión con plasmina de la fibrina estabilizada, y (c) un sustrato quimioluminiscente, ES 2 366 043 T3 en el que uno de los anticuerpos monoclonales (a) y (b) es portado por una partícula magnética, y el otro está marcado con una enzima, cuyo sustrato es el sustrato quimioluminiscente. 6.- Un procedimiento para detectar la trombosis de venas profundas y/o la embolia pulmonar, que se caracteriza porque analiza los productos digeridos con plasmina del fibrinógeno contenidos en una muestra mediante el procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o el kit según la reivindicación 5. 11 ES 2 366 043 T3 12