Un procedimiento in vitro o ex vivo de detección de trombosis o el grado de trombofilia,

caracterizado porque lamedición de una proteasa de escisión del factor de von Willebrand, en el que la trombosis está seleccionada entre elgrupo que consiste en leucemia mieloide aguda o crónica, leucemia promielocítica aguda leucemia linfocítica aguda.

Procedimiento de detección de trombosis mediante la medición de la proteasa de escisión del factor de von Willebrand.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un procedimiento para detectar trombosis o el grado de gravedad de trombofilia en base a la medición de una proteasa de escisión del factor de von Willebrand como se caracteriza por las reivindicaciones anexas. La presente invención se puede llevar a cabo mediante el uso de un procedimiento inmunológico con un anticuerpo monoclonal y / o un anticuerpo policlonal contra la proteasa de escisión del factor de von Willebrand.

Técnica anterior

Cuando una pared de un vaso sanguíneo está dañada y el tejido subendotelial es expone al flujo sanguíneo, las plaquetas en el flujo sanguíneo rápidamente se adhieren al tejido subendotelial. La adhesion requiere un factor de von Willebrand (de aquí en adelante llamado simplemente "vWF") en plasma. El vWF desencadena una serie de etapas de activación, tal como agregación de plaquetas y una liberación de gránulos intracelulares, y después, se forma trombos que conducen a hemostasis. En general, el vWF se secreta a partir de un endotelio vascular a la sangre en forma de una macromolécula que tiene un peso molecular de más de 20.000 kDa, y se escinde por una metaloproteasa, la proteasa de escisión de vWF, en multímeros que tienen pesos moleculares de 500 a 20.000 kDa, que circulan a través de la sangre. Cuando se produce una enfermedad (es decir, cuando se provoca un alto esfuerzo de cizalla por oclusión o similares) , la conformación de vWF cambia a una estructura expandida. Se sabe que el vWF expandido tiene alta actividad de agregación de plaquetas, y el vWF expandido es propenso a que se degrade por la proteasa de escisión de vWF. Se considera que cuando la actividad de la enzima se reduce por alguna razón, las moléculas de vWF "inusualmente grandes" se sobreproducen en la sangre y se unen de manera eficaz a plaquetas y, como resultado, se promueve la agregación de plaquetas en los vasos sanguíneos para formar trombos en microcirculación. Tal formación de trombos implicada en las plaquetas es esencial para los mecanismos hemostáticos fisiológicos. Sin embargo, los trombos provocan enfermedades trombóticas (tal como infarto de miocardio, infarto cerebral, o trombosis cerebral) , que son una causa principal de muerte y un serio problema en la sociedad anciana.

Se ha clarificado que la proteasa de escisión de vWF está implicada en la púrpura trombótica trombocitopénica (de aquí en adelante llamada simplemente "PTT") que es extremadamente grave y tiene un alto grado de fatalidad, que un autoanticuerpos, que inhibe la actividad de la proteasa de escisión de vWF se produce en PTT aguda y esporádica, y que la actividad de la proteasa de escisión de vWF es inactiva en PTT familiar. Aunque una parte de de la proteasa de escisión de vWF se purificó en 1996 (referencia de no patente 1) , el total de la misma no estuvo identificado hasta 2001. Debido a que la proteasa de escisión de vWF muestra su actividad enzimática solamente en la presencia de 1, 5 mol/l de urea/5 mmol/l de tampón Tris (pH 8, 0) in vitro, era difícil identificar la proteasa de escisión de vWF como una sustancia. Recientemente, se purificó la proteasa de escisión de vWF en plasma (referencias de no patentes 2 y 3) . Además, se clonó su ADNc, y el gen, que pertenece a una familia de ADAMTS (un tipo de desintegrina y metaloproteasa con el motivo de tipo 1 de trombospondina) , se denominó ADAMTS13 (referencias de no patentes 4 y 5) . En el mismo período de tiempo, se clarificó que la actividad de la proteasa de escisión de vWF se reducía de manera significativamente en PTT familiar, debido a una mutación del gen de la proteasa de escisión de vWF ADAMTS13 (referencia de no patente 6) .

La actividad de la proteasa de escisión de vWF se midió detectando los múltímeros grandes de vWF, usando una combinación de una electroforesis de SDS-agarosa y autorradiografía o transferencia de Western (referencia de no patente 1) . Sin embargo, este procedimiento de medición contiene etapas complicadas, y de este modo, comúnmente no es un ensayo de laboratorio clínico. Por ejemplo, en este procedimiento de medición, se requiere un vWF sin proteasa, el procedimiento dura 3 días, y los valores medidos a menudo varían según los laboratorios. Recientemente, se desarrolló un procedimiento de medición de la actividad de la proteasa de escisión de vWF, que comprende las etapas de expresión de una región parcial de de un dominio A2 (un sitio a ser escindido por la proteasa de escisión de vWF) del vWF en Escherichia coli usando técnicas de recombinación genética, mezclando la proteína recombinante con una muestra derivada de un paciente durante un período predeterminado, para escindir el dominio A2 por la proteasa de escisión de vWF contenida en la muestra, y detectar los productos escindidos por una combinación de electroforesis de SDS y transferencia de Western, (referencia de no patente 7) . Sin embargo, este procedimiento también contiene etapas complicadas, tal como la preparación de la proteína recombinante o electroforesis, y de este modo, es difícil de usar este procedimiento en la mayoría de los laboratorios.

La púrpura idiopática trombocitopénica (PTI) es una enfermedad en la que no se conocen los síntomas característicos y causas claras de la enfermedad, y se produce trombocitopenia por la destrucción de plaquetas promovida por mecanismos inmunológicos. En la mayoría de los casos, PTI se considera una enfermedad autoinmune provocada por un autoanticuerpo contra una plaqueta. Como un antígeno reconocido por un anticuerpo anti-plaqueta derivado de un paciente que sufre PTI, se identificó una proteína de membrana de plaqueta GPIIb-IIIa, y se desarrollaron muchos procedimientos para detectar un anticuerpo específico para esta proteína. Entre estos

procedimientos, se usa de manera amplia un ensayo de captura de antígeno que usa un anticuerpo monoclonal contra GPIIb-IIIa. Se sabe que este procedimiento muestra una alta especificidad con una pequeña cantidad de falsos positivos. Sin embargo, la mayoría de los anticuerpos monoclonales que se pueden usar en este procedimiento no están comercialmente disponibles, y se requieren etapas complicadas, tal como una recogida de 5 plaquetas o una disolución de plaquetas, y de este modo, se requieren el desarrollo y estandarización de un kit conveniente. El documento WO 02/42441 describe un polipéptido de la proteasa de escisión de vWF, una molécula de ácido nucleico que codifica su secuencia de aminoácidos amino y una composición que comprende el polipéptido. También el documento WO 03/016492 describe tal proteasa y ácidos nucleicos que codifican lo mismo, así como un mutante y sus formas variantes. Konetschny et al. 2003 describe un Ensayo Inmunoabsorbente Ligado

a Enzimas (ELISA) para la detección de la proteasa de escisión de vWF en plasma humano.

[referencia de no patente 1] M.Furlan et al., Blood, U.S.A., 1996, vol.87, p.4223 -4234

[referencia de no patente 2] H. Gerritsen et al., Blood, U.S.A., 2001, vol.98, p.1654 -61

[referencia de no patente 3] K. Fujikawa et al., Blood, U.S.A., 2001, vol.98, p.1662 -6

[referencia de no patente 4] X. Zheng et al., The Journal of Biological Chemistr y , U.S.A., 2001, vol.276, p. 41059 -63

[referencia de no patente 5] K. Soejima et al., The Journal of Biochemistr y , 2001, vol.130, p.475 -80

[referencia de no patente 6] G. G. Levy et al., Nature, United Kingdom, 2001, vol. 413, p.488 -494

[referencia de no patente 7] K.Kokame et al., Blood, U.S.A., 2003, 08, 2861 (en prensa)

Divulgación de la invención

PROBLEMAS A RESOLVER POR LA INVENCIÓN

Como se ha descrito anteriormente, no estaba establecido un procedimiento para detectar de manera conveniente y precisa las causas de la trombosis implicadas en la agregación de plaquetas y / o trombosis, y se ha deseado tal procedimiento. Por lo tanto, un objeto de la presente invención es establecer tal procedimiento deseado para detectar el grado de trombofilia en trombosis implicada en la agregación de plaquetas. El procedimiento de detección se puede usar como un procedimiento de diagnosis que dirige un tratamiento novedoso de trombosis, tal como un

aumento de velocidad de supervivencia o una determinación de tratamiento en base a los síntomas. Los presentes inventores llevaron a cabo estudios intensivos y,... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento in vitro o ex vivo de detección de trombosis o el grado de trombofilia, caracterizado porque la medición de una proteasa de escisión del factor de von Willebrand, en el que la trombosis está seleccionada entre el grupo que consiste en leucemia mieloide aguda o crónica, leucemia promielocítica aguda leucemia linfocítica aguda.

5 2. El procedimiento de acuerdo con reivindicación 1, en el que el grado de trombofilia se detecta en un paciente bajo tratamiento a largo plazo con diálisis acompañado de derivación repetida.

3. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que una disminución de la concentración de la proteasa de escisión del factor de von Willebrand se usa como un índice, en comparación con el de personas sanas.

10 4. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la proteasa de escisión del factor de von Willebrandis es medida inmunológicamente usando un anticuerpo que específicamente se une a la proteasa de escisión del factor de von Willebrand, o un fragmento del anticuerpo.

5. Uso de un anticuerpo que específicamente se une a una proteasa de escisión del factor de von Willebrand, o un fragmento del anticuerpo para la preparación de una composición de diagnóstico para la medición de una proteasa

de escisión del factor de von Willebrand para la detección de trombosis o el grado de trombofilia, en el que la trombosis se selecciona entre el grupo que consiste en leucemia mieloide aguda o crónica, leucemia promielocítica aguda y leucemia linfocítica aguda.