ADN Y PROTEÍNAS O PÉPTIDOS ESPECÍFICOS DE BACTERIAS DE LA ESPECIE NEISSERIA MENINGITIDIS, PROCEDIMIENTOS PARA SU OBTENCIÓN Y SUS APLICACIONES BIOLÓGICAS.

LOS ADN DE LA INVENCION SE CARACTERIZAN PORQUE SE TRATA TOTAL O PARCIALMENTE DE GENES,

CON SU FASE DE LECTURAS, PRESENTES EN NEISSERIA MENINGITIDIS, PERO AUSENTE EN NEISSERIA GONORRHOEAE O EN NEISSERIA LACTAMICA CON LA EXCEPCION DE LOS GENES IMPLICADOS EN LA BIOSINTESIS DE LA CAPSULA POLISACARIDICA, FRPA, FRPC, OPC, PORA, ROTAMASA DE LA SECUENCIA IC1106, IGA PROTEASAS, PILINA, PILC, PROTEINAS QUE LIGAN LA TRANSFERRINA Y PROTEINAS DE OPACIDAD. LA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A LOS POLIPEPTIDOS QUE CORRESPONDEN A ESTOS ADN Y A LOS ANTICUERPOS DIRIGIDOS CONTRA ESTOS POLIPEPTIDOS. APLICACIONES EN LA PREVENCION Y EN LA DETECCION DE INFECCIONES CON MENINGOCOCOS Y DE MENINGITIS

La invención se refiere a los ADN y a las proteínas y péptidos, específicos de bacterias de la especie Neisseria meningitidis (en lo sucesivo en este documento abreviada Nm), a su procedimiento de obtención y a sus aplicaciones biológicas, en particular para la detección de infecciones meningocócicas y meningitis.

Se sabe que Nm constituye uno de los principales agentes de la meningitis cerebroespinal.

Estudios realizados en los Estados Unidos han demostrado que del 5 al 10% de la población son portadores asintomáticos de la cepa (o cepas) de Nm. Los factores de transmisión de Nm no se conocen bien. Para una proporción de individuos infectados, Nm se introduce en el flujo sanguíneo, donde puede provocar una meningococemia y/o progresa en el flujo cerebroespinal para provocar una meningitis. Sin tratamiento antibiótico rápido, la infección puede desarrollarse de manera fulgurante y volverse mortal.

En comparación con otros patógenos, Nm presenta la característica de poder atravesar la barrera hematoencefálica con objeto de colonizar las meninges. Por lo tanto, el estudio de la patogenicidad de Nm no es solamente importante en el cuadro de la meningitis, sino también en el cuadro de cualquier enfermedad que afecte al cerebro.

Se concibe por tanto el interés de disponer de herramientas específicas de esta especie bacteriana para las aplicaciones anteriormente contempladas.

Genéticamente Nm está muy próxima a bacterias de la especie Neisseria gonorrhoeae (en lo sucesivo en este documento abreviada Ng) y de la especie Neisseria lactamica (en lo sucesivo en este documento abreviada Nl). Sin embargo su patogenicidad es muy diferente.

Nm coloniza la nasofaringe, después atraviesa el epitelio faríngeo para invadir el espacio sub-mucoso, siendo por tanto responsable de septicemia y meningitis.

Ng es sobre todo responsable de infecciones localizadas del tracto genito- urinario. Ésta coloniza la mucosa genital, después atraviesa el epitelio, invade a continuación el sub-epitelio donde se multiplica y es responsable de una fuerte reacción inflamatoria. Son posibles infecciones gonocócicas diseminadas, aunque son raras y son de hecho solo ciertas cepas. En cuanto a Nl, se considera que se trata de una cepa no patógena, dado que no es responsable de invasión localizada o general.

Por tanto, una primera consideración lleva a tener en cuenta el hecho de que Nm y Ng, aun siendo bacterias muy próximas, presentan poderes patógenos diferentes.

Aunque el genoma de estas bacterias es fuertemente homólogo, sólo partes limitadas del genoma del Nm y de Ng deben codificar factores de virulencia específicos, responsables de su patogénesis.

Está claro que Nm presenta, con respecto a Ng, secuencias de ADN que le son específicas y que deben intervenir al nivel de la expresión de su poder patógeno específico.

La especie Nm se subdivide en serogrupos basados en la naturaleza de polisacáridos capsulares.

Se han definido al menos 13 serogrupos, entre los cuales los serogrupos A, B y C son responsables de aproximadamente 90% de los casos de meningitis. Los grupos A y C se observan en las formas epidémicas de la enfermedad. El grupo B es el serogrupo más normalmente aislado en Europa y en los Estados Unidos.

La cápsula, presente en Nm y ausente en Ng, ha servido de base para la elaboración de vacunas contra la meningitis meningocócica.

Los polisacáridos de la cápsula de Nm se han utilizado para la elaboración de una vacuna que se ha mostrado eficaz para prevenir la meningitis en adultos provocada por meningococos de los serogrupos A, C, W135 e

Y.

Sin embargo, el polisacárido de Nm del grupo C se muestra débilmente inmunógeno en niños menores de dos años, mientras que el polisacárido de Nm del grupo B no es inmunógeno en el ser humano y comparte epítopos con glucoproteínas de adhesión presentes en las células neuronales humanas.

No existe por tanto vacuna universal que pueda prevenir las infecciones provocadas por el conjunto de los serogrupos de meningococos y que pueda responder a la variabilidad antigénica característica de los patógenos bacterianos en general y de Nm en particular.

Gracias a la reactividad cruzada del polisacárido del grupo B de Nm con los antígenos humanos, a la multiplicidad de los serogrupos y a la variabilidad antigénica del Nm, las estrategias propuestas actualmente no pueden conducir a una vacuna eficaz en todas las situaciones.

Las investigaciones se han concentrado por tanto en el estudio de elementos característicos responsables de la especificidad de la patogénesis meningocócica.

La mayoría de los genes que se han estudiado en cualquiera de las dos bacterias Nm o Ng poseen su homólogo en la segunda bacteria.

De la misma manera, la mayoría de los factores de virulencia hasta ahora identificados en Nm tienen una contrapartida en Ng, es decir la pilina, las proteínas PilC, las proteínas de opacidad y los receptores de lactoferrina y transferrina.

Los atributos específicos de los meningococos caracterizados en la técnica anterior son la cápsula, las proteínas Frp análogas a las toxinas RTX, las proteínas de la membrana externa Opc, la glutatión peroxidasa, la porina PorA y el gen rotamasa.

Entre éstos, sólo la cápsula se presenta invariablemente en las cepas virulentas de Nm. Sin embargo, numerosos patógenos extracelulares poseen una cápsula sin atravesar por tanto la barrera hematoencefálica.

Por tanto, los atributos aún no identificados deben ser responsables de la especificidad de la patogénesis meningocócica. Probablemente secuencias de ADN presentes entre los meningococos pero ausentes en los gonococos codifican estos atributos.

Los autores de la invención han desarrollado una nueva vía de enfoque basada en el aislamiento sustractivo de genes Nm específicos, debiendo estar estos genes unidos a la patogénesis específica de Nm y, más particularmente, al paso de la barrera hematoencefálica.

El método sustractivo desarrollado en la técnica anterior ha llevado a la producción de marcadores epidemiológicos para determinados aislados de Nm. Estos marcadores tienen una utilidad limitada: no abarcan el conjunto de serogrupos de la especie Nm.

A diferencia de estos estudios, los trabajos de los inventores han conducido, comparando Nm con el conjunto del cromosoma de Ng, escindido de manera aleatoria, a la puesta a punto de medios para clonar el conjunto de los ADN presentes en Nm y ausentes en Ng, proporcionando así herramientas de alta especificidad con respecto a Nm y permitiendo de esta manera responder por primera vez a la variabilidad genética de la especie.

Los términos “presente” y “ausente”, tal como se usan en la descripción y en las reivindicaciones en relación con los ADN de una cepa, o sus productos de expresión, se evalúan en relación con las misma condiciones de hibridación (16 h a 65 ºC, con NaPO4 0,5 M, pH 7,2; EDTA-Na 0,001 M, albúmina de suero bovino al 1% y dodecilsulfato de sodio al 7%, seguido de 2 lavados en una solución que comprende NaPO4 40 mM pH 7,2, EDTA 1 mM y SDS al 1%; realizándose el lavado final a 65ºC durante 5 min), utilizando una misma sonda y una misma intensidad de marcaje de la sonda, una misma cantidad de ADN cromosómico y un mismo elemento de comparación (ADN cromosómico de la cepa homóloga).

De esta manera, se considera que el ADN está presente cuando la señal obtenida con la sonda es prácticamente la misma que la obtenida con la cepa de referencia.

Por otro lado, se considera que el ADN está ausente cuando esta señal aparece muy débil.

Una segunda consideración sobre las patogenicidades de Nm y Ng conduce a tener en cuenta su capacidad común para colonizar y penetrar la mucosa después de invadir el espacio sub-epitelial de esta última. Es muy probable que este proceso implique factores de virulencia comunes a los dos patógenos. A este respecto, se sabe que ya se ha identificado un determinado número de factores de virulencia en Nm y en Ng, como las proteínas pili, PilC, las proteínas de opacidad, las proteasas de IgA, las proteínas de unión a la transferrina y a la lactoferrina y lipooligosacáridos.

La gestión de los autores de la invención se amplia por tanto a... [Seguir leyendo]

1. ADN aislado específico de Neisseria caracterizado porque se trata

- del ADN de secuencia SEC ID Nº: 10, o del ADN de secuencia SEC ID Nº: 36 o de un ADN específico de Nm de la cepa Z2491 que se hibrida en transferencia de Southern con el ADN de la secuencia SEC ID Nº: 10, pero no se hibrida en transferencia de Southern con una secuencia de ADN de una cepa de Neisseria gonorrohoeae (en lo sucesivo en este documento Ng), en las siguientes condiciones de hibridación:

16 h a 65ºC, con una solución que comprende NaPO4 0,5 M, pH 7,2; EDTA-Na 0,001 M, 1% de albúmina de suero bovina y 7% de dodecilsulfato de sodio; seguido de 2 lavados en una solución que comprende NaPO4 40 mM pH 7,2, EDTA 1 mM y SDS al 1%; realizándose el lavado final a 65ºC durante 5 min;

- o del ADN de secuencia SEC ID Nº: 95 o, de un ADN o de un ADN de Nm de la cepa Z2491 y de Ng de la cepa MS11 que se hibrida en transferencia de Southern con el ADN de la secuencia SEC ID Nº: 95, pero no se hibrida con una secuencia de ADN de una cepa de Neisseria lactamica (en lo sucesivo en este documento Nl), en las siguientes condiciones de hibridación:

16 h a 65ºC, con una solución que comprende NaPO4 0,5 M, pH 7,2; EDTA-Na 0,001 M, 1% de albúmina de suero bovina y 7% de dodecilsulfato de sodio; seguido de 2 lavados en una solución que comprende NaPO4 40 mM pH 7,2, EDTA 1 mM y SDS al 1%; realizándose el lavado final a 65ºC durante 5 min.

2. Los ADN complementarios sobre toda la longitud de las secuencias del ADN de acuerdo con la reivindicación 1.

3. El ADN de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque codifica una proteína exportada más allá de la membrana citoplásmica.

4. El ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque está insertado en un vector de transferencia o de expresión tal como un cósmido, plásmido o bacteriófago.

5. Célula hospedadora, más particularmente célula bacteriana o célula de Nm, transformada por inserción de al menos un ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

6. ARN, caracterizado porque su secuencia corresponde a la transcripción de una secuencia de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, entendiéndose que estos ARN se hibridan con la secuencia SEC ID Nº: 10, 36 ó 95.

7. Polipéptido, caracterizado porque está codificado por un ARN de acuerdo con la reivindicación 6, entendiéndose, en lo que concierne a la secuencia SEC ID Nº: 36, que se trata de fases de lectura de las posiciones 1330 a 2970 ó 3083 a 9025.

8. Polipéptido, caracterizado porque presenta una cadena de aminoácidos codificada por una fase de lectura que se hibrida con la secuencia SEC ID Nº: 10; o 36, que corresponde a las fases de lecturas de las posiciones 1330 a 2970 ó 3083 a 9025; o 95; las condiciones de hibridación definidas en la reivindicación 1.

9. Polipéptido, caracterizado porque presenta la secuencia SEC ID Nº: 37 ó SEC ID Nº: 38.

10. Método de diagnóstico de una infección meningocócica y más particularmente meningitis meningocócica para demostrar la presencia de Nm en una muestra biológica, caracterizado por que comprende las etapas de:

- poner en contacto una muestra biológica a analizar, con un reactivo que comprende la SEC ID Nº: 10 o la SEC ID Nº: 95, o el ADN complementario de estas secuencias, opcionalmente en forma de sonda nucleotídica, en condiciones que permitan una hibridación o una reacción de tipo antígeno-anticuerpo, respectivamente y

- detección del producto de reacción eventualmente formado.

11. Composición, caracterizada porque comprende al menos un polipéptido de acuerdo con una de las reivindicaciones 7 a 9, en asociación con un vehículo fisiológicamente aceptable.