VECTORES DE EXPRESION VIRAL PARA PLANTAS.

Secuencia de ácido nucleico, que comprende:

(a) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de movimiento viral alterado que comprende mutaciones puntuales en residuos de aminoácidos codificados por los dos codones que incluyen,

respectivamente, las posiciones del nucleótido 5213 y 5203 de SEQ ID Nº 1; y

(b) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un complejo replicasa alterado 126/183 que incluye mutaciones puntuales en residuos de aminoácidos codificados por los dos codones que incluyen, respectivamente, las posiciones del nucleótido 1138 y 2382 de SEQ ID Nº 1; en la que las alteraciones mejoran la capacidad de retener un transgen contenido en un virus que expresa el movimiento de la proteína alterada

Vectores de expresión viral para plantas.

Campo técnico

La presente invención se refiere al campo de la virología vegetal. Concretamente, la invención se refiere a la síntesis de secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína de movimiento viral alterado, y un complejo replicante alterado, según se describe en las reivindicaciones, y a la construcción de vectores virales que expresen dicha proteína, así como a la generación de plantas de acogida infectadas por los vectores virales. Los vectores virales permiten una rápida invasión local y sistémica, y permiten la expresión estable de un interesante transgen.

Antecedentes de la invención

En los últimos quince años se han conseguido notables progresos en la expresión de genes foráneos en plantas. Actualmente, las proteínas foráneas se producen de forma rutinaria en muchas especies de plantas para la modificación de la planta o para la producción de proteínas para su utilización con posterioridad a la extracción. Se han obtenido vectores para la manipulación genética de plantas a partir de diversos virus de plantas generados de forma natural. Para la producción de proteínas específicas, la expresión transitoria de genes foráneos en plantas, utilizando vectores basados en virus, cuenta con diversas ventajas. Los productos de virus vegetales se encuentran entre las proteínas producidas con mayor frecuencia en plantas. Con frecuencia, un producto de gen viral es la principal proteína producida en células vegetales durante la replicación del virus. Muchos virus son capaces de desplazarse de manera sistémica desde el punto inicial de una infección hacia la práctica totalidad de las células de la planta. Debido a estas razones, se han desarrollado virus vegetales en vectores eficientes de expresión transitoria para genes foráneos en plantas. Los virus de plantas multicelulares son relativamente pequeños, lo que probablemente se debe al límite de tamaño de las vías que permiten que los virus viajen hasta las células adyacentes en la infección sistémica de plantas completas. Uno de dichos virus vegetales en los que se basan los vectores de expresión vegetal es el TMV (virus del mosaico del tabaco). El TMV es el miembro tipo del grupo tobamovirus. El TMV tiene viriones tubulares rectos de aproximadamente 300 x 18 nm, con un canal hueco de 4 nm de diámetro consistente en aproximadamente 2000 unidades de una sola proteína de la cápside dispuesta helicoidalmente en torno a una sola molécula de ARN. Las partículas del virión consisten en un 95% en peso de proteína y en un 5% de ARN. El genoma del TMV está compuesto por un ARN de una sola hélice formado por 6395 nucleótidos que contienen cinco grandes ORFs. La expresión de cada gen se regula de forma independiente. El virión ARN sirve de mensajero ARN (mRNA) para los genes 5', codificando la subunidad de replicasa 126 kDa y la subunidad de replicasa solapada 183 kDa que se genera mediante la lectura a través de un codón finalizador de ámbar aproximadamente un 5% del tiempo. La expresión de lo genes internos está controlada por los diferentes promotores en el sentido ARN menos que dirigen la síntesis de 3'- mRNAs subgenómicos coterminales producidos durante la replicación. Una descripción detallada del la expresión del gen del tobamovirus y del ciclo vital puede encontrarse, entre otros lugares, en Dawson and Lehto, Advances in Virus Research, 38: 307-342 (1991). El documento WO 95/21248 describe un vector viral recombinante que expresa una proteína de movimiento alterado truncado, que se deriva en una mayor estabilidad del transgen.

De este modo, resulta interesante desde un punto de vista científico y comercial proporcionar vectores nuevos y mejorados para la manipulación genética de las plantas.

Resumen de la invención

Un aspecto principal de la presente invención consiste en el diseño de un vector viral recombinante que exprese una proteína de movimiento alterado y proteínas víricas alteradas 126/183, como se describe en las reivindicaciones, que afecten a la expresión estable de un transgen en una planta de acogida.

De este modo, la presente invención proporciona una secuencia aislada de ácido nucleico que codifica una proteína de movimiento viral alterado con la secuencia de aminoácido que se muestra en SEQ ID NºS 5 y 6, y proteínas víricas 126/183 alteradas. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico aislada es esencialmente idéntica a la secuencia mostrada en SEQ ID NºS 3 y 4, y contiene un residuo de Timina (T) o Uracilo (U) en la posición 5213 y un residuo de Guanina (G) en 5303, como se muestra en la figura 1A. En otro aspecto, la secuencia aislada de ácido nucleico es idéntica a la secuencia mostrada en SEQ ID NºS 3 y 4. La alteración de la proteína de movimiento 30K y de las proteínas víricas 126/183 tiene como resultado una mayor capacidad para facilitar la estabilización de un transgen contenido en un vector viral.

En una realización independiente, la presente invención proporciona un vector viral que comprende la secuencia de ácido nucleico definida en las reivindicaciones que codifica una proteína de movimiento viral alterado que contiene la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NºS 5 y 6 y proteínas víricas alteradas 126/183. En un aspecto determinado, el vector viral presenta una mayor capacidad, en comparación con un vector viral de control, para estabilizar un transgen contenido en el vector. Preferiblemente, el vector es un vector viral del mosaico del tabaco. Un vector especialmente preferido se designa mediante SG1057 (depositado en la Recopilación de Cultivos Tipo Americanos, con el número de acceso 20398, depositada el 28 de abril de 1999).

En un aspecto independiente incluido en esta realización, el vector viral comprende un transgen interesante. Preferiblemente, el transgen es un gen no viral que codifica una proteína seleccionada del grupo consistente en una proteína de membrana, una proteína citosólica, una proteína secretada, una proteína nuclear y una proteína chaperone.

La presente invención también proporciona una célula vegetal transformada con un vector viral.

Breve descripción de las ilustraciones

La figura 1 describe una comparación de las secuencias de nucleótido que codifican una proteína de movimiento alterado contenida en el vector BSG 1057 (SEQ ID Nº 4) y la proteína de movimiento negativo contenida en el vector BSG 1037 (SEQ ID Nº 3). Las identidades de la secuencia se indican mediante *, y las discrepancias se indican mediante.

La figura 2 muestra una comparación de las secuencias de aminoácido que codifican una proteína de movimiento alterado contenida en el vector BSG 1057 (SEQ ID Nº 6) y la proteína de movimiento negativo contenida en el vector BSG 1037 (SEQ ID Nº 5). Las identidades de la secuencia se indican mediante *, y las discrepancias se indican mediante.

La figura 3 es una representación esquemática de los puntos de restricción del vector BSG 1037.

La figura 4 es una representación esquemática de los puntos de restricción del vector BSG 1057.

La figura 5 es la secuencia completa de BSG 1037 (SEQ ID Nº 1).

La figura 6 es la secuencia completa de BSG 1057 (SEQ ID Nº 2).

La figura 7 es un mapa esquemático de los lugares de las mutaciones en BSG 1057.

La figura 8 muestra plantas N. benthamiana a los 20 días de la inoculación. Hay cuatro columnas de cinco plantas. La primera columna de la izquierda muestra las plantas inoculadas con el primer pasaje de BSG 1037. La Columna 2 es el séptimo pasaje de BSG 1037, la Columna 2 es el primer pasaje de BSG 1057, la Columna 4 es el séptimo pasaje de BSG 1057.

Modalidades de realización de la invención

En esta descripción se hace referencia a diversas publicaciones, patentes y especificaciones de patentes publicadas mediante una cita identificadora. Las revelaciones de dichas publicaciones, patentes y descripciones de patentes publicadas quedan incorporadas por referencia a la presente descripción, a fin de describir más específicamente el estado de la técnica a la que pertenece la invención. Por ejemplo, la enseñanza general de construcción de vectores virales vegetales y su utilización para la infección sistémica de plantas y proteínas heterólogas expresas procedentes de las mismas, y se describe en las patentes estadounidenses números 5.316.931; 5.977.438; 5.889.191; 5.889.190; 5.866.785 y 5.816.653, cuyas enseñanzas quedan incorporadas al presente documento por referencia.

Técnicas generales

La...

1. Secuencia de ácido nucleico, que comprende:

(a) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de movimiento viral alterado que comprende mutaciones puntuales en residuos de aminoácidos codificados por los dos codones que incluyen, respectivamente, las posiciones del nucleótido 5213 y 5203 de SEQ ID Nº 1; y

(b) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un complejo replicasa alterado 126/183 que incluye mutaciones puntuales en residuos de aminoácidos codificados por los dos codones que incluyen, respectivamente, las posiciones del nucleótido 1138 y 2382 de SEQ ID Nº 1;

en la que las alteraciones mejoran la capacidad de retener un transgen contenido en un virus que expresa el movimiento de la proteína alterada.

2. Vector viral que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1.

3. Vector viral de la reivindicación 2, en el que dichas mutaciones puntuales del nucleótido tienen como resultado las siguientes sustituciones de aminoácido:

       Thr a Ile en el residuo codificado por el codón que incluye la posición del nucleótido 5213 de SEQ ID Nº 1;

       Lys a Arg en el residuo codificado por el codón que incluye la posición del nucleótido 5303 de SEQ ID Nº 1;

       Glu a Gly en el residuo codificado por el codón que incluye la posición del nucleótido 1138 de SEQ ID Nº 1; y

       Lys a Glu en el residuo codificado por el codón que incluye la posición del nucleótido 2382 de SEQ ID Nº 1.

4. Vector viral de las reivindicaciones 2 o 3, en el que la proteína de movimiento viral alterado comprende mutaciones puntuales T104I y K134R.

5. Vector viral de la reivindicación 2, en el que dichas mutaciones puntuales del nucleótido comprenden:

       - C a T en el nucleótido correspondiente a la posición 5213 de SEQ ID Nº 1;

       - A a G en el nucleótido correspondiente a la posición 5303 de SEQ ID Nº 1;

       - A a G en el nucleótido correspondiente a la posición 1138 de SEQ ID Nº 1; y

       - A a G en el nucleótido correspondiente a la posición 2382 de SEQ ID Nº 1.

6. Vector viral de la reivindicación 5, que comprende adicionalmente las mutaciones puntuales:

       - T a C en el nucleótido correspondiente a la posición 1268 de SEQ ID Nº 1;

       - G a A en el nucleótido correspondiente a la posición 3632 de SEQ ID Nº 1; y

       - C a A en el nucleótido correspondiente a la posición 5896 de SEQ ID Nº 1.

7. Vector viral de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, que comprende el ácido nucleico de SEQ ID Nº 2.

8. Vector viral de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, designada con la referencia BSG 1057, depositada en la Recopilación de Cultivos Tipo Americanos, con el número de acceso 20398.

9. Vector viral de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, en la que el transgen es un gen no viral.

10. Vector viral de la reivindicación 9, en el que el transgen no viral codifica una proteína seleccionada del grupo consistente en una proteína de membrana, una proteína citosólica, una proteína secretada, una proteína nuclear y una proteína chaperone.

11. Vector viral de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, en el que el vector es un vector del virus del mosaico del tabaco.

12. Célula vegetal transformada con el vector viral de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11.

13. Secuencia de ácido nucleico de SEQ ID Nº 2.