Método para mejorar la eficiencia del uso de agua en plantas.

Un método de aumento de la eficiencia de uso del agua por una planta,

comprendiendo el método:

(a) transformar una población de plantas con una casete de expresión recombinante que comprende un promotor SARK inducible por senescencia enlazado operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica isopentenil-transferasa; y

(b) seleccionar una planta que tiene una eficiencia de uso del agua incrementada, en donde el promotor SARK es (i) al menos 95% idéntico al promotor de SEQ ID NO: 1 o (ii) al menos 95% idéntico a 800 pb del extremo 5' de SEQ ID NO: 1.

Método para mejorar la eficiencia del uso de agua en plantas Antecedentes de la invención

Estudios fisiológicos y genéticos indican que la senescencia es un proceso estrechamente regulado (Nooden, Senescence and Aging in Plants, (L. D. Nooden y A. C. Leopold, Ed.), pp. 391-439, Academic Press, San Diego, Calif., 1988;Thomas, et al., Ann. Rev. Plant Physiol. 31:83-111, 1980). Estudios moleculares sugieren que cambios en la expresión génica están asociados con el programa de senescencia. Por ejemplo, el nivel de mRNA codificante de las proteínas implicadas en la fotosíntesis disminuye durante la senescencia (Bate, et al., J. Exp. Bot. 42:801-811, 1991; Hensel, et al., Plant Cell 5:553-564, 1993; Jiang, et al., Plant Physiol. 101:105- 112, 1993), en tanto que los niveles de mRNA de los genes que codifican proteínas que se cree están implicadas en el programa de la senescencia aumentan (Graham, et al., Plant Cell 4:349-357, 1992, Hensel, et al., Plant Cell 5:553-564, 1993; Kamachi, et al., Plant Physiol. 93:1323-1329, 1992; Taylor, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5118-5122, 1993).

Se ha sugerido que promotores específicos de la senescencia pueden utilizarse para impulsar la expresión de genes selectos durante la senescencia. La patente U.S. 5.689.042, por ejemplo, utiliza un constructo genético que comprende un promotor específico de la senescencia, SAG12, enlazado operativamente a una secuencia de DNA codificante de isopentil-transferasa (IPT) de Agrobacterium que no está conectada en la naturaleza a la secuencia promotora. Las plantas transgénicas que comprenden este constructo retienen hojas verdes durante más tiempo por impulsar la expresión de IPT por medio del promotor SAG12. Es sabido que IPT aumenta el nivel de citoquinina, una clase de hormonas de plantas cuya concentración disminuye durante la senescencia y por tanto puede jugar un papel en el control de la senescencia de las hojas.

Análogamente, Gan y Amasino han demostrado que la inhibición de la senescencia de las hojas puede conseguirse por producción autorregulada de citoquinina (Gao, et al, Science 270:1986-1988, 1995). Otros promotores inducibles de senescencia han sido identificados. Por ejemplo, el promotor SARK de Phaseolus vulgaris se describe en WO 99/29159 y Hajouj et al. Plant Physiol. 124:1305-1314 (2000).

Un aspecto útil y deseable de regulación interna de la expresión del gen de interés reside en la posibilidad de regular la expresión únicamente en aquellas células que sufren senescencia, dejando así las células normales inafectadas y exentas de los efectos posiblemente negativos de la superproducción de citoquinina.

Aunque se ha demostrado que el uso de la expresión controlada de IPT porSAG12 controla la senescencia de las hojas, otros fenotipos de tales plantas no están bien comprendidos. La presente invención aborda estas y otras necesidades.

Breve sumario de la invención

La presente invención se refiere a un método de aumentar la eficiencia de uso del agua por una planta. Esta invención está dirigida a la preparación de plantas transgénicas que expresan una proteína implicada en la síntesis de citoquinina bajo el control de un promotor inducible por senescencia.

Los métodos de medición comprenden (a) transformar en una población de plantas una casete de expresión recombinante que comprende un promotor SARK inducible por senescencia enlazado operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína implicada en la síntesis de citoquinina; y (b) seleccionar una planta que es resistente al estrés de sequía. El paso de Introducción de la casete de expresión puede realizarse utilizando cualquier método conocido. Por ejemplo, la casete expresión puede introducirse por un cruce sexual o utilizando Agrobacterium.

El promotor SARK se prepara convenientemente a partir de Phaseolus vulgaris y puede tener una secuencia al menos 95 % Idéntica a SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la proteína implicada en la síntesis de citoquinina es ¡sopentenll-transferasa (IPT) de Agrobacterium. Una secuencia Ilustrativa de IPT es una que es al menos 95% Idéntica a SEQ ID NO: 3.

La secuencia puede introducirse en cualquier planta capaz de transformación con constructos de expresión recomblnantes. En esta memoria se ¡lustra la expresión en tabaco. Otras plantas convenientemente utilizadas en la Invención Incluyen céspedes de hipódromo.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra que las plantas de tabaco WT exhibían un marchitamiento progresivo de las hojas, mientras que dos linajes transgénlcos independientes no exhibían síntomas de marchitamiento durante un estrés de sequía de 5 y 7 días sin agua.

Las Figuras 2A-2L muestran plantas de tabaco de 4 meses sometidas a estrés de sequía seguido por rehidrataclón. Tanto las plantas de tipo salvaje (Flg. 2A) como las plantas transgénicas (Figs. 2B y 2C) exhibían síntomas de

marchitamiento de las hojas al cabo de 7 días de sequía. Los síntomas de marchitamiento de las hojas se hacían más pronunciados después de 18 días de sequía, tanto en WT (Fig. 2D) como en los dos linajes transgénicos (Figs. 2E y 2F). La rehidratación de las plantas durante 7 días tenía poco efecto sobre las plantas WT marchitas (Fig. 2G), pero inducía una recuperación parcial de los linajes transgénicos (Fig. 2H y 2I) mostrando el linaje transgénico T4-24 (Fig. 2I) mejor recuperación que el linaje transgénico T2-36 (Fig. 2H). La rehidratación de las plantas durante 14 días no recuperaba las plantas WT (Fig. 2J), pero recuperaba por completo ambos linajes transgénicos (Figs. 2K y 2L).

La Figura 3 muestra el peso fresco de las plantas que se representan en Fig. 2 después de 14 días de rehidratación. Los valores son la media ± SD (n = 40).

La Figura 4 muestra plantas WT de Arabidopsis y plantas transgénicas T1 (pSARK:IPT) después de estrés de sequía y 5 días de hidrataclón.

Descripción detallada de la invención

Definiciones

Como se utilizan en esta memoria, los términos "resistencia a la sequía" o "tolerancia a la sequía" se refieren a la capacidad de una planta para recuperarse de periodos de estrés de sequía (es decir, escasez o ausencia total de agua durante un periodo de días). Típicamente, el estrés de sequía será al menos 5 días y puede serían largo como 18 a 20 días.

El término "eficiencia de uso del agua" se refiere a la capacidad de una planta para crecer sin prácticamente penalidad alguna de rendimiento durante periodos prolongados con menos de las cantidades normales (por regla general aproximadamente la mitad) de agua.

El término "senescencia" (al que se hace referencia también como muerte celular programada) se refiere a un proceso activo, generalmente controlado, por el cual las células y tejidos de las plantas pierden organización y función.

El término "gen asociado a la senescencia" se refiere a un gen implicado en la senescencia. La expresión de un gen de esta clase puede ser Inducida (o alterada) durante el proceso de la senescencia.

Como se utiliza esta memoria, el término "promotor" incluye todas las secuencias capaces de impulsar la transcripción de una secuencia codificante en la célula de la planta. Así, los promotores utilizados en los constructos de la invención incluyen elementos de control de la transcripción con acción cis y secuencias reguladoras que están implicadas en la regulación o modulación de la temporización y/o la velocidad de transcripción de un gen. Por ejemplo, un promotor puede ser un elemento de control de la transcripción con acción cis, que incluye un intensificado^ un promotor, un terminador de la transcripción, un origen de replicación, una secuencia de integración cromosómica, regiones 5' y 3' no traducidas, o una secuencia intrónica, que están implicadas en la regulación de la transcripción. Estas secuencias de acción cis interaccionan típicamente con proteínas u otras biomoléculas para llevara cabo (activar/desactivar, regular, modular, etc.) la transcripción.

Un "promotor inducible por maduración" es un promotor que confiere especificidad temporal de una secuencia codificante enlazada operativamente tal que la expresión ocurre a la finalización de la maduración y/o durante el proceso de senescencia.

Un "promotor inducible por senescencia" es un promotor que confiere especificidad temporal de una secuencia codificante enlazada operativamente tal que la expresión ocurre durante el proceso de senescencia.

El término "planta" incluye plantas enteras, órganos/estructuras de brotes vegetativos (v.g. hojas, tallos y tubérculos), raíces, flores y órganos/estructuras florales (v.g. brácteas, sépalos, pétalos,... [Seguir leyendo]

1. Un método de aumento de la eficiencia de uso del agua por una planta, comprendiendo el método:

(a) transformar una población de plantas con una casete de expresión recomblnante que comprende un promotor SARK inducible por senescencia enlazado operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica isopentenil-transferasa; y

(b) seleccionar una planta que tiene una eficiencia de uso del agua incrementada, en donde el promotor SARK es (i) al menos 95% idéntico al promotor de SEQ ID NO: 1 o (ii) al menos 95% idéntico a 800 pb del extremo 5 de SEQ ID NO: 1.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el paso de transformación se lleva a cabo utilizando Agrobacterium.

3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en donde el promotor SARK es dePhaseolus vulgarís.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la secuencia de ácido

nucleico que codifica la isopentenil-transferasa es de Agrobacterium.

5. El método de la reivindicación 4, en donde la isopentenil-transferasa es al menos 95% idéntica a SEQ ID NO: 3.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la planta es una dicotiledónea.

7. El método de la reivindicación 6, en donde la planta es tabaco.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la planta es una monocotiledónea.

9. El método de la reivindicación 8, en donde la planta es del género Oryza.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la planta es de uno de los

géneros siguientes: Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Cucumis, Cucúrbita, Daucua, Festuca, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Oryza, Panicum, Pannesetum, Persea, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Secale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum, Trigonella, Triticum, Vitis, Vigna y Zea.

11. Uso de una casete de expresión recombinante que comprende un promotor SARK inducible por senescencia, enlazado operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica isopentenil-transferasa para aumentar la eficiencia de uso del agua por una planta, en donde el promotor SARK es (i) al menos 95% idéntico al promotor de SEQ ID NO: 1 o (ii) al menos 95% idéntico a 800 pb del extremo 5 de SEQ ID NO: 1.

12. Uso conforme a la reivindicación 11, en donde el promotor SARK es como se define en la reivindicación 3.

13. Uso conforme a la reivindicación 11 ó 12, en donde la secuencia de ácido nucleico es como se define en la reivindicación 4 ó 5.

14. Uso conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en donde la planta es como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10.