Genes de la PKS de Schizochytrium.

Una molécula de ácido nucleico aislada, que comprende:

(a) una secuencia de ácido nucleico o porción de la misma seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nº71,

SEC ID Nº 69 y SEC ID Nº 76, en la que la secuencia de ácido nucleico o porción de la misma codifica unasecuencia de aminoácidos que tiene al menos una actividad de gen de síntesis de tipo policétidos (de tipo PKS); o

(b) una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos o porción de la misma seleccionadadel grupo que consiste en las SEC ID Nº 72 SEC ID Nº 70 y SEC ID Nº 73, en la que la secuencia de aminoácidos oporción de la misma tiene al menos una actividad de gen de síntesis de tipo policétidos (de tipo PKS).

Genes de la PKS de Schizochytrium

Introducción Campo de la invención La presente invención se refiere a niveles de modulación de enzimas y/o componentes enzimáticos capaces de modificar los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (PUFA) en una célula huésped y a construcciones y a métodos para producir PUFA en una célula huésped. La invención se ejemplifica mediante la producción de ácido eicosapentenoico (EPA) usando genes derivados de Shewanella putrefaciens y de Vibrio marinus.

Antecedentes Existen dos familias principales de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) que son los ácidos grasos ω3, ejemplificados por el ácido eicosapentaenoico y los ácidos grasos ω6, ejemplificados por el ácido araquidónico. Los PUFA son componentes importantes de la membrana plasmática de las células, en donde pueden hallarse en formas tales como los fosfolípidos y también se pueden encontrar en triglicéridos. Los PUFA también sirven como precursores de otras moléculas importantes en los seres humanos y animales, incluyendo las prostaciclinas, los leucotrienos y las prostaglandinas. Los PUFA de cadena larga principales incluyen el ácido docosahexaenoico (DHA) y el ácido eicosapentanoico (EPA) , que se hallan primordialmente en diferentes tipos de aceites de pescado, el ácido gammalinolénico (GLA) , que se halla en las semillas de un cierto número de plantas, incluyendo la onagra (Oenothera biennis) , la borraja (Borago officinalis) y el grosellero negro (Ribes nigrum) y el ácido estearidónico (SDA) , que se encuentra en aceites marinos y semillas de plantas y el ácido araquidónico, que junto con el GLA se halla en los hongos filamentosos. El ARA puede purificarse a partir de tejidos animales, incluyendo el hígado y la glándula suprarrenal. Varios géneros de bacterias marinas sintetizan EPA o DHA. El DHA está presente en la leche humana junto con el ARA.

Los PUFA son necesarios para un correcto desarrollo, particularmente en el cerebro en desarrollo de los niños y para la formación y reparación de tejidos. Como ejemplo, el DHA es un importante constituyente de muchas membranas celulares humanas, en particular de las células nerviosas (materia gris) , células musculares y espermatozoides y se cree que afecta al desarrollo de las funciones cerebrales en general y es esencial para el desarrollo de la visión. El EPA y el DHA tienen una serie de usos nutricionales y farmacológicos. Como ejemplo los adultos afectados por diabetes (especialmente los no insulinodependientes) muestran deficiencias y desequilbrios en sus niveles de DHA que se cree que contribuyen a afecciones coronarias posteriores. Por tanto, una dieta equilibrada con DHA puede ser beneficiosa para los diabéticos.

Para el DHA, existen numerosas fuentes para la producción comercial incluidos diversos organismos marinos, aceites obtenidos a partir de peces marinos de aguas frías y fracciones de la yema del huevo. La purificación del DHA a partir de fuentes de peces es relativamente cara debido a dificultades técnicas, lo que hace del DHA algo caro y escaso. En algas tales como Amphidinium y Schizochytrium y hongos marinos tales como Thraustochytrium el DHA puede representar hasta el 48 % del contenido en ácidos grasos de la célula. También se ha notificado que unas pocas bacterias producen DHA. Estas son en general bacterias de las profundidades marinas tales como Vibrio 45 marinus. Para ARA, pueden usarse para su producción comercial microorganismos incluyendo los géneros Mortierella, Entomophthora, Phytium y Porphyridium. Las fuentes comerciales de SDA incluyen los géneros Trichodesma y Echium. Las fuentes comerciales de GLA incluyen la onagra, el grosellero negro y la borraja. Sin embargo, hay varias desventajas asociadas con la producción comercial de PUFA a partir de fuentes naturales. Las fuentes naturales de PUFA, tales como animales y plantas, tienden a tener composiciones de aceites altamente heterogéneas. Los aceites obtenidos a partir de estas fuentes pueden por tanto requerir purificación extensa para separar uno o más PUFA deseados, o para producir un aceite que esté enriquecido en uno o más PUFA deseados.

Las fuentes naturales están sometidas también a fluctuaciones incontrolables en su disponibilidad. Las reservas de peces pueden experimentar variaciones naturales o pueden agotarse por sobrepesca. Los aceites animales y

particularmente los aceites de peces, pueden acumular contaminantes medioambientales. El tiempo y las enfermedades pueden causar fluctuaciones en los rendimientos de ambas fuentes, peces y plantas. La tierra cultivable disponible para la producción de cultivos alternativos productores de aceites está sometida a la competición procedente de la continua expansión de las poblaciones humanas y de la creciente necesidad asociada a la producción de alimentos en las tierras arables que quedan. Los cultivos que sí producen PUFA, tales como la borraja, no han sido adaptados al crecimiento comercial y pueden no comportarse bien en monocultivo. El crecimiento de tales cultivos es por tanto económicamente no competitivo cuando pueden cultivarse cultivos más provechosos y mejor establecidos. La fermentación a gran escala de organismos tales como Shewanella también es cara. Los tejidos animales naturales contienen cantidades bajas de ARA y son difíciles de procesar. Los microorganismos tales como Porphyridium y Shewanella son difíciles de cultivar a escala comercial.

Los suplementos dietarios y las formulaciones farmacéuticas que contienen PUFA pueden retener las desventajas de la fuente de PUFA. Los suplementos tales como las cápsulas de aceite de pescado pueden contener niveles bajos del componente concreto deseado y por tanto requerir dosis elevadas. Las dosis elevadas dan lugar a la ingestión de niveles elevados de componentes no deseados, incluyendo contaminantes. Debe tenerse cuidado al proporcionar suplementos de ácidos grasos, puesto que la sobreadición puede dar lugar a la supresión de las rutas biosintéticas endógenas y conducir a una competición con otros ácidos grasos necesarios en varias fracciones de lípidos in vivo, conduciendo a resultados no deseables. Por ejemplo, los esquimales que tienen una dieta rica en ácidos grasos ω3 tienen una tendencia incrementada a sangrar (Patente estadounidense nº 4.874.603) . Los aceites de pescado tienen sabores y olores desagradables, que pueden ser imposibles de separar, en términos económicos, del producto deseado, tal como suplementos alimenticios. Los sabores y olores desagradables de los suplementos pueden hacer indeseables regímenes tales que implican el suplemento y pueden inhibir la conformidad por parte del paciente.

Se ha identificado un número de enzimas que están implicadas en la biosíntesis de los PUFA. El ácido linoleico (LA,

18:2 Δ 9, 12) se produce a partir del ácido oleico (18:1 Δ9) mediante una Δ12-desaturasa. El GLA (18:3 Δ 6, 9, 12) se produce a partir del ácido linoleico (LA, 18:2 Δ9, 12) mediante una Δ6-desaturasa. El ARA (20:4 Δ 5, 8, 11, 14) se produce a partir de DGLA (20:3 Δ 8, 11, 14) , catalizada por una Δ5-desaturasa. El ácido eicosapentenoico (EPA) es un ácido graso omega 3 de 20 átomos de carbono que contiene 5 dobles enlaces (Δ 5, 8, 11, 14, 17) , todos ellos en configuración cis. El EPA y el DHA relacionado (Δ 4, 7, 10, 13, 16, 19, C22:6) se producen a partir del ácido oleico mediante una serie de reacciones de elongación y desaturación. Adicionalmente, se necesita una elongasa (o elongasas) para prolongar los PUFA de 18 carbonos hasta longitudes de 20 y 22 carbonos. No obstante, los animales no pueden convertir el ácido oleico (18:1 Δ 9) en ácido linoleico (18:2 Δ 9, 12) . Asimismo, los mamíferos no pueden sintetizar el ácido μ-linolénico (ALA, 18:3 Δ 9, 12, 15) . Otros eucariotas, incluyendo los hongos y las plantas, tienen enzimas que desaturan en las posiciones Δ12 y Δ15. Por tanto, los principales ácidos grasos poliinsaturados de los animales se derivan de la dieta y/o de la desaturación y elongación del ácido linoleico (18:2 Δ 9, 12) o del

ácido μ-linolénico (18:3 Δ 9, 12, 15) .

Los ácidos grasos poliinsaturados se consideran que son útiles para fines nutricionales, farmacéuticos, industriales y otros. Un suministro expansivo de ácidos grasos poliinsaturados a partir de fuentes naturales y de síntesis química no es suficiente para las necesidades comerciales. Debido a que se requiere un número de enzimas desaturasas y elongasas distintas para la síntesis de ácidos grasos a partir de ácido linoleico (LA, 18:2 Δ 9, 12) , común en la mayoría de las especies vegetales, para los PUFA más saturados y de cadena más larga,... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ácido nucleico aislada, que comprende:

(a) una secuencia de ácido nucleico o porción de la misma seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nº 71, SEC ID Nº 69 y SEC ID Nº 76, en la que la secuencia de ácido nucleico o porción de la misma codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una actividad de gen de síntesis de tipo policétidos (de tipo PKS) ; o

(b) una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos o porción de la misma seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nº 72 SEC ID Nº 70 y SEC ID Nº 73, en la que la secuencia de aminoácidos o porción de la misma tiene al menos una actividad de gen de síntesis de tipo policétidos (de tipo PKS) .

2. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, en la que la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nº 72, SEC ID Nº70 y SEC ID Nº 73.

3. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 2, en la que la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nº 71, SEC ID Nº 69 y SEC ID Nº 76.

4. Una proteína aislada codificada por la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 unida operablemente a un promotor.

6. Una célula microbiana recombinante que comprende el menos una copia de una molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

7. Un método para la producción de un ácido graso poliinsaturado de cadena larga en un cultivo de células microbianas, comprendiendo el método cultivar un cultivo de células microbianas que tiene una pluralidad de células microbianas recombinantes como se establece en la reivindicación 6, en condiciones en las que un ácido graso poliinsaturado de cadena larga se produce por el cultivo de células microbianas.

8. Una célula vegetal recombinante que comprende al menos una copia de una molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

9. Un método para la producción de un ácido graso poliinsaturado de cadena larga en una célula vegetal, comprendiendo el método cultivar una planta que tiene una pluralidad de células vegetales recombinantes como se establece en la reivindicación 8, en condiciones en las que un ácido graso poliinsaturado de cadena larga se produce en las células vegetales.