Procedimientos y medios mejorados para producir hialuronano.

Una célula vegetal genéticamente modificada que tiene una molécula de ácido nucleico que codifica una hialuronano sintasa vinculada a secuencias reguladoras que aseguran la transcripción en células vegetales integradas de manera estable en su genoma,

en la que dicha célula vegetal tiene adicionalmente una pluralidad de moléculas de ácido nucleico extrañas integradas de manera estable en su genoma, en la que una primera molécula de ácido nucleico extraña codifica una proteína que tiene la actividad de una glutamina:fructosa 6-fosfato amidotransferasa-2 (GFAT-2) que se origina a partir de animales o una glutamina:fructosa 6-fosfato amidotransferasa (GFAT) que se origina a partir de bacterias y una segunda molécula de un ácido nucleico extraña que codifica una proteína que tiene la actividad de una UDP-glucosa deshidrogenasa (UDP-Glc-DH) y en la que dicha célula vegetal genéticamente modificada tiene una actividad aumentada de una proteína que tiene la actividad de una glutamina:fructosa 6-fosfato amidotransferasa (GFAT) y una actividad aumentada de una proteína que tiene la actividad de una UDP-glucosa deshidrogenasa (UDP-Glc-DH) en comparación con las células vegetales no modificadas genéticamente correspondientes.

de las secuencias

SECIDN°1: Secuencia de ácido nucleico que codifica una hialuronano sintasa de Paramec/um bursar/a

Cb/ore//a virus 1.

SEO ID N° 2: Secuencia de aminoácidos de una hialuronano sintasa del Paramec/am barsana Cb/ore//a virus 1.

La secuencia de aminoácidos que se muestra, que se puede derivar de la SEC ID N° 1.

SEC ID N° 3: La secuencia sintética de ácido nucleico que codifica una hialuronano sintasa de un Paramec/am

barsana Cb/ore//a virus 1. La síntesis de los codones de la secuencia que se muestra se realizó de tal manera que se adaptó al uso de codones en células vegetales. La secuencia de ácido nucleico que se muestra codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID N°2.

SEC ID N° 4: Una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que tiene la actividad de una UDP-Glc-

DH de Paramec/am barsana Cb/ore//a virus 1.

SEC ID N° 5: La secuencia de aminoácidos de una proteína que tiene la actividad de una UDP-Glc-DH de

Paramec/am barsana Cb/ore//a virus 1. La secuencia de aminoácidos que se muestra, que se puede derivar de la SEC ID N° 4.

SEC ID N°6: Una secuencia de ácido nucleico sintético que codifica una proteína que tiene la actividad de una

UDP-Glc-DH de Paramec/am barsana Cb/ore//a virus 1. La síntesis de los codones de la secuencia que se muestra se realizó de tal manera que se adaptó al uso de codones en células vegetales. La secuencia de ácido nucleico que se muestra codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID N° 5.

SEC ID N° 7: La secuencia de ácido nucleico de una proteína que tiene la actividad de una GFAT-1 procedente

de ratón.

SEC ID N° 8: La secuencia de aminoácidos de una proteína que tiene la actividad de una GFAT-1 procedente de

ratón. La secuencia de aminoácidos que se muestra, que se puede derivar de la SEC ID N° 7.

SEC ID N° 9: La secuencia de ácido nucleico de una proteína que tiene la actividad de una GFAT-2 procedente

de ratón.

SEC ID N° 10: La secuencia de aminoácidos de una proteina que tiene la actividad de una GFAT-2 procedente de ratón. La secuencia de aminoácidos que se muestra, que se puede derivar de la SEC ID N° 9.

SEC ID N° 11: La secuencia de àcido nucleico que codifica una proteina que tiene la actividad de una GFAT

procedente de Esc/7er/c/?/a co//.

SEC ID N° 12: La secuencia de aminoácidos de una proteina que tiene la actividad de una GFAT de Esc/?enc/?/a co//. La secuencia de aminoácidos que se muestra, que se puede derivar de la SEC ID N° 11.

SEC ID N° 13: La secuencia de àcido nucleico sintético que codifica una proteina que tiene la actividad de una

GFAT procedente de Esc/?enc/?/a co//. La síntesis de los codones de la secuencia que se muestra se realizó de tal manera que se adaptó al uso de codones en células vegetales. La secuencia de ácido nucleico que se muestra codifica una proteina que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID N° 12.

SEC ID N° 14: Ollgonucleótldo sintético usado como cebador en el Ejemplo 1

SEC ID N° 15: Ollgonucleótldo sintético usado como cebador en el Ejemplo 1

Descripción de ias figuras

Figura 1: Muestra una curva de calibración y la correspondiente ecuación de la línea de regresión utilizada para

calcular el contenido de hlaluronano en el tejido de la planta. La curva de calibración se estableció con la ayuda del kit de ensayo comercial (kit de ensayo del ácido hialurónico (AH) de Corgenix, Inc., Colorado, EE.LIU, N° de producto 029-001) y las soluciones normalizadas suministradas al anterior.

Procedimientos generaies

Se describen a continuación los procedimientos que se pueden usar junto con la presente invención.

1. Transformación de plantas de patata

Las plantas de patata se transformaron con ayuda de Agrobacfer/um, tal como se describe en Rocha-Sosa y col. EMBOJ. 8, (1989), 23-29).

2. Aislamiento de hlaluronano del tejido vegetal

Para detectar la presencia de hlaluronano y determinar el contenido de hialuronano en el tejido vegetal, el material vegetal se trabajó de la siguiente forma: se añadieron aproximadamente 200 pl de agua (desmineralizada, conductividad = 18 MQ) a aproximadamente 0,3 g de material de tubérculo, y la mezcla se trituró en un molino de bolas oscilante de laboratorio (MM200, de Retsch, Alemania) (30 s a 30 Hz). A continuación se añadieron aproximadamente 800 pl más de agua (desmineralizada, conductividad = 18 MQ), y la mezcla se mezcló bien (utilizando, por ejemplo, un mezclador Vortex). Los residuos celulares y los componentes insolubles se separaron del sobrenadante por centrifugación a 16 000 xg durante 5 minutos.

3. Purificación de hialuronano

Se pelaron aproximadamente 100 gramos de tubérculos, se recortaron en trozos de un tamaño de aproximadamente 1 cm^ y, tras adición de 100 mi de agua (desmineralizada, conductividad = 18 MQ), se trituraron en un mezclador Warrlng a la velocidad máxima durante aproximadamente 30 segundos. Los residuos celulares se eliminaron a continuación usando una manga de té. Los residuos celulares que se habían eliminado se resuspendieron en 300 mi de agua (desmlnerallzada, conductividad = 18 MQ) y se volvieron a retirar usando una manga de té. Las dos suspensiones obtenidas (100 mi + 300 mi) se combinaron y se centrifugaron a 13 000 xg durante 15 minutos. Se añadió NaCI al sobrenadante de la centrifugación obtenido hasta alcanzar una concentración final del 1%. Lina vez que el NaCI se hubo disuelto, la precipitación se realizó por adición de dos veces el volumen de etanol seguido por la mezcla completa e Incubación a -20 °C durante la noche. A continuación la mezcla se centrifugó a 13 000 durante 15 minutos. El precipitado sedimentado obtenido tras esta centrifugación se disolvió en 100 mi de tampón (TrisHCI 50 mM, pH 8, CaCl21 mM) y a continuación se añadió proteinasa K hasta una concentración final de 100 mg/ml y la solución se Incubó a 42 °C durante 2 horas. Esto fue seguido por 10 minutos de incubación a 95 °C. Lina vez más, se añadió NaCI a esta solución hasta alcanzar una concentración final del 1%. Lina vez que el NaCI se hubo disuelto, se realizó otra precipitación por adición de dos veces el volumen de etanol, mezcla completa e incubación a -20 °C durante aproximadamente 96 horas. Esto fue seguido por 15 minutos de centrifugación a 13 000 x g. El precipitado sedimentado obtenido tras esta centrifugación se disolvió en 30 mi de agua (desmineralizada, conductividad = 18 MQ), y una vez más, se añadió NaCI hasta una concentración final de 1%. Al añadir dos veces el volumen de etanol, mezcla completa e incubación a -20 °C durante la noche, se produjo otra precipitación. El precipitado obtenido tras la posterior centrifugación a 13 000 xg durante 15 minutos se disolvió en 20 mi de agua (desmineralizada, conductividad = 18 MQ).

Se realizó otra purificación mediante filtración centrífuga. Con este fin, en cada caso 5 mi del precipitado disuelto se

aplicaron a un filtro de membrana (CentriconAmicon, anchura de poro 10 000 NMWL, Prod. N° UCF8 01096), y la muestra se centrifugó a 2200 xg hasta que solo permanecieron aproximadamente 3 mi de la solución por encima del filtro. Dos veces más, tras adición de 3 mi de agua (desmineralizada, conductividad = 18 MQ) a la solución por encima de la membrana y, en cada caso, se volvieron a centrifugar en condiciones idénticas hasta que, finalmente, solamente permanecieron aproximadamente 3 mi de la solución por encima del filtro. Las soluciones aún presentes por encima de la membrana después de la filtración centrífuga se eliminaron, y la membrana se lavó repetidamente (de tres a cinco veces) con aproximadamente 1,5 mi de agua (desmineralizada, conductividad = 18MQ). Todas las soluciones que quedaban por encima de la membrana y las soluciones obtenidas del lavado se combinaron, se añadió NaCI hasta una concentración final de 1%, una vez que el NaCI se hubo disuelto, se añadió dos veces el volumen de etanol, la muestra se mezcló y se obtuvo un precipitado por almacenamiento a -20 °C durante la noche. El precipitado obtenido tras la posterior centrifugación a 13 000 xg durante 15 minutos se disolvió en 4 mi de agua (desmineralizada, conductividad= 18 MQ) y después se criodesecó (24 horas a una presión de 0,37 mbar, equipo de criodesecación Christ Alpha 1-4 de Christ, Osterode, Alemania).

4. Detección de hialuronano y determinación del contenido de hialuronano

El hialuronano se detectó usando una prueba comercial (kit de ensayo de ácido hialurónico... [Seguir leyendo]

1. Una célula vegetal genéticamente modificada que tiene una molécula de ácido nucleico que codifica una hialuronano sintasa vinculada a secuencias reguladoras que aseguran la transcripción en células vegetales integradas de manera estable en su genoma, en la que dicha célula vegetal tiene adicionalmente una pluralidad de moléculas de ácido nucleico extrañas integradas de manera estable en su genoma, en la que una primera molécula de ácido nucleico extraña codifica una proteína que tiene la actividad de una glutamina:fructosa 6-fosfato amidotransferasa-2 (GFAT-2) que se origina a partir de animales o una glutamina:fructosa 6-fosfato amidotransferasa (GFAT) que se origina a partir de bacterias y una segunda molécula de un ácido nucleico extraña que codifica una proteína que tiene la actividad de una UDP-glucosa deshidrogenasa (UDP-Glc-DH) y en la que dicha célula vegetal genéticamente modificada tiene una actividad aumentada de una proteína que tiene la actividad de una glutamina:fructosa 6-fosfato amidotransferasa (GFAT) y una actividad aumentada de una proteína que tiene la actividad de una UDP-glucosa deshidrogenasa (UDP-Glc-DH) en comparación con las células vegetales no modificadas genéticamente correspondientes.

2. La célula vegetal genéticamente modificada de acuerdo con la reivindicación 1 que sintetiza una cantidad aumentada de hialuronano en comparación con las células vegetales que tienen la actividad de una hialuronano sintasa y una actividad no aumentada de una glutamina:fructosa 6-fosfato amidotransferasa (GFAT) y una actividad no aumentada de una UDP-glucosa deshidrogenasa.

3. Una célula que comprende las células vegetales genéticamente modificadas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2.

4. Material de propagación de una planta de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende las células vegetales genéticamente modificadas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2.

5. Una parte de planta cosechable de una planta de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende las células vegetales genéticamente modificadas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2.

6. Un procedimiento de preparación de una planta que sintetiza hialuronano, que comprende

a) modificar genéticamente una célula vegetal, en el que la modificación genética comprende las etapas i a i¡¡ siguientes

i) introducción de una molécula de ácido nucleico extraña que codifica una hialuronano sintasa unida a secuencias reguladoras que aseguran la transcripción en células vegetales en la célula vegetal ¡i) introducción de una molécula de ácido nucleico extraña en la célula vegetal, comprendiendo la molécula de ácido nucleico extraña una secuencia de codificación de una proteína que tiene la actividad de una glutamina:fructosa 6-fosfato amidotransferasa-2 (GFAT-2) que se origina de animales o una glutamina:fructosa 6-fosfato amidotransferasa (GFAT) que se origina de bacterias

i¡¡) introducción de una molécula de ácido nucleico extraña en la célula vegetal, comprendiendo la molécula de ácido nucleico extraña una secuencia de codificación de una proteína que tiene la actividad de una glutamina:fructosa 6-fosfato UDP-glucosa deshidrogenasa

en el que las etapas i a iii se pueden realizar en cualquier orden, individualmente, o cualquier combinación de las etapas i a iii se puede realizar simultáneamente

b) regenerando una planta a partir de las células vegetales de la etapa a).

7. Un procedimiento de preparación de hialuronano que comprende la etapa de extraer hialuronano a partir de células vegetales genéticamente modificadas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, a partir de plantas de acuerdo con la reivindicación 3, a partir del material de propagación de acuerdo con la reivindicación 4, o a partir de partes cosechables de plantas de acuerdo con la reivindicación 5.

8. El uso de una célula vegetal genéticamente modificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, una planta de acuerdo con la reivindicación 3, material de propagación de acuerdo con la reivindicación 4 o las partes cosechables de la planta de acuerdo con la reivindicación 5 para la preparación de hialuronano.

9. Un procedimiento de preparación de una composición que comprende hialuronano en el que son usadas las células vegetales genéticamente modificadas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, las plantas de acuerdo con la reivindicación 3, material de propagación de acuerdo con la reivindicación 4, o las partes cosechables de la planta de acuerdo con la reivindicación 5.

10. El uso de células vegetales genéticamente modificadas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, de plantas de acuerdo con la reivindicación 3, de material de propagación de acuerdo con la reivindicación 4 o de las partes de la planta cosechables para la preparación de una composición de acuerdo con la reivindicación 5 para preparar una composición.