Plantas transgénicas que expresan SPIC o proteínas de inteína modificada y método relacionado.

Una planta, o parte de la planta, plántula, tejido, célula, fracción subcelular,

semilla, plantón, protoplasto, descendencia o descendiente recombinante, caracterizada(o) por que tiene una construcción de expresión que codifica una proteína modificada que comprende una proteína diana y una secuencia de inteína de la polimerasa de Pyrococcus spp. (pol Psp) variante que tiene una metionina en el resto de aminoácido 534, en el que la secuencia de inteína pol Psp variante se fusiona dentro de la proteína diana en una posición tal que la presencia de la inteína reduce sustancialmente la actividad de la proteína modificada, y donde la proteína diana es una proteína lignocelulósica degradante y la secuencia de inteína pol Psp variante es térmicamente inducible para producir el corte y empalme en cis de la proteína modificada por la planta, parte de la planta, plántula, tejido, célula, fracción subcelular, semilla, plantón, protoplasto, descendencia o descendiente recombinante que tiene una temperatura de 50 ºC o mayor.

Plantas transgénicas que expresan SPIC o proteínas de inteína modificada y método relacionado

Antecedentes

Campo de la invención

La presente invención se refiere a plantas transgénicas que expresan proteínas de inteína modificada, a métodos para la producción de las plantas transgénicas, a métodos para la expresión en plantas de proteínas de inteína modificada, y a diversos usos de y a productos que contienen las plantas transgénicas que expresan proteínas de inteína modificada.

Descripción de los antecedentes

Dado que los combustibles fósiles son recursos no renovables, para el futuro se requiere garantizar suministros adecuados de energía y de materias básicas orgánicas. Una transición a los recursos sostenibles requiere nuevas tecnologías para la construcción de materias básicas mejoradas, el diseño de procesos eficientes para convertir las materias básicas en productos valiosos y/o el diseño de productos que utilicen eficientemente un espectro de sustratos modificados. Esta transformación creará beneficios tales como menor contaminación de la producción y uso de la energía, menor contaminación de los procesos de fabricación de productos químicos, mayor sostenibilidad a través de la utilización de fuentes naturales renovables y de productos residuales orgánicos como sustratos, menor dependencia de materiales primas de países extranjeros y aumento en la economía local y mercados implicados en la producción de nuevos sustratos.

La blomasa vegetal es un recurso sostenible que puede ayudar a atender las necesidades futuras de las materias básicas. El uso de las plantas como sustratos para energía, productos químicos, productos farmacéuticos y materias básicas orgánicas se beneficia de la producción agrícola a gran escala, usa la energía solar para incorporar el dióxido de carbono en las plantas mediante la fotosíntesis y tiene escasos subproductos ambientalmente tóxicos. Mediante el uso de la fotosíntesis, las plantas fabrican el dióxido de carbono eliminado del aire disponible para la producción de energía, productos químicos y productos agrícolas. La búsqueda de modos para redistribuir eficazmente este carbono en formas que sean fácil y económicamente empleables sigue siendo un reto.

La producción de materias básicas químicas y combustibles de la biomasa vegetal está aún en pañales. Las materias primas basadas en almidón, por ejemplo, pueden aplicarse para la producción de productos químicos tangibles. El empobrecimiento de sustratos y la biodisponibilidad de cepas complican la bioconversión, junto con las cuestiones se seguridad, reales o percibidas, relacionadas con la contaminación, y una ausencia de viabilidad económica, han ralentizado particularmente el progreso en este área. La biomasa no celulósica, tal como el almidón de maíz, se comparara favorablemente con recursos fósiles desde el punto de vista de la masa, pero es demasiado costosa. En cambio, la biomasa celulósica, tal como álamo de corta rotación, pino, césped de pradera, forraje de maíz, bagazo de caña de azúcar, lodo de papel residual y residuos sólidos urbanos, es rentable tanto en cuanto a masa como a energía. Sin embargo, la biomasa celulósica, debido a su textura compleja, es difícil de procesar. Actualmente, la biomasa celulósica requiere pretratamiento con ácidos fuertes, bases y/u otros productos químicos para su uso como un sustrato para combustible, por ejemplo, etanol o para la producción químicas, por ejemplo productos de papel. Este pretratamiento expone eficazmente subunidades poliméricas, principalmente hexosas, pentosas y compuestos fenólicos, que después se escinden y se usan como sustratos, pero es costoso. Una alternativa al uso de productos químicos más tóxicos es el uso de enzimas, aunque esto no es rentable.

La tecnología de ADN recombinante se ha aplicado para modificar microorganismos para realizar la bioconversión de sustratos a costes reducidos, ampliando de este modo el uso de microorganismos y aumentando el número de productos que se producen. Por ejemplo, se han construido células de plantas que expresan enzimas lignocelulósicas degradantes, aunque raramente se diferencian y se regeneran en plantas completas debido a la descomposición de componentes estructurales. En los casos en los que se diferencian en plantas completas, por ejemplo, con sustratos de lignina y celulosa, las actividades enzimáticas son bajas y las plantas requieren procesamiento adicional. Intentos para combinar el pretratamiento de la biomasa de sustratos con fermentación también han encontrado dificultades, en parte debido a las limitaciones de transferencia de masa y a la interferencia con el organismo fermentador.

Las Secuencias de Proteínas Intermedias Controlables (SPIC) o inteínas son péptidos de autoescisión en fase, que generalmente se producen como parte de una molécula de proteína precursora más grande. Las SPIC o inteínas difieren de otras proteasas o zimógenos en diversas formas fundamentales. A diferencia de las proteasas que se autoescinden u otras proteínas en polipéptidos múltiples, no ligados, las SPIC o inteínas tienen la capacidad tanto de escindirse como de ligarse bien en conformación cis o trans. Por tanto en vez de escisión terminal, que resultaría de la reacción de una proteasa en una proteína, las SPIC o inteínas tienen la capacidad de escindir en sitios múltiples y ligar los fragmentos de proteína resultantes. Esta escisión se induce en condiciones específicas y pueden modificarse por ingeniería genética usando técnicas de biología molecular. Las SPIC o inteínas se han descrito en la

bibliografía en Sacchromyces cerevisiae (Kane et. al., Science 25: 651; Hirata et al., J. Bio. Chem. 265: 6726 (199)), Mycobacteríum tuberculosis (Davis et al., J. Bact. 173: 5653 (1991), Davis et al., Cell 71: 1 (1992)), Thermococcus litoralis (Perler, et al., PNAS 89: 5577 (1992)), y en otros microorganismos.

El documento WO 9/5991 se refiere a construcciones de expresión multigénica que contienen inteínas modificadas y a su uso para la introducción de genes múltiples en plantas usando un solo suceso de transformación. El corte y empalme de la inteína parece que se produce espontáneamente y no hay explicaciones de que pueda inducirse. Sun et al., Protein transsplicing to Produce Herbicide-Resistant Acetolactate Synthase, Applied and Environmental Microbiology, Vol. 67 (3), marzo 21, p. 125-129 describen el corte y empalme de proteínas en trans usando la inteína DnaE (de Synechocystis) para producir acetolactato slntasa resistente a herbicidas funcional a partir de dos fragmentos génicos no enlazados en E. coli. Se dice que proporciona un modelo para el diseño de transgenes no transferidles en plantas. Sin embargo, no hay una explicación clara de que el corte y empalme de la Inteína pueda producirse realmente en células o en tejidos de plantas. Wang et al., Identification of an Unusual Intein in Chloroplast CIpP Protease of Chlamydornonas eugametos, Journal of Blological Chemistry, 2 de mayo 1997, Vol. 272, N° 18, p. 11869-11873 y el documento US 5496714 describen la aplicación de la tecnología de inteína y la producción de proteínas modificadas en organismos distintos de plantas.

Por consiguiente, existe una necesidad de mejorar nuevos métodos para la producción de energía y otros productos químicos o productos químicos o farmacéuticos a partir de fuentes más fácilmente renovables, tales como modificando plantas de tal manera que puedan usarse como materias primas energéticas y químicas.

Sumario

La presente invención proporciona plantas, sus partes, plántulas, semillas, plantones, y su descendencia (mencionado en su conjunto como "plantas") genéticamente recombinantes, que pueden contener secuencias génicas exógenas sencillas o múltiples, estando cada una interrumpida por, o fusionada a secuencias de inteína sencillas o múltiples, y opcionalmente secuencias reguladoras adecuadas para la expresión génica y la transformación de una planta. Las secuencias génicas modificadas pueden expresarse constitutiva o transitoriamente, a lo largo de toda la planta o en tejidos específicos, o cualquier combinación de la misma, que incluye secuencias génicas de inteína modificada tanto sencillas como múltiples. En diferentes realizaciones de la invención, cualquier secuencia génica modifica, o conjunto de secuencias génicas modificadas, puede expresarse en cualquiera o todos los tejidos constitutivamente o en momentos específicos.

La invención también se refiere a métodos para la producción de plantas transgénlcas que comprenden genes de inteína modificada, por ejemplo, construyendo primero un segmento de ADN que comprenda el gen parental de inteína modificada,... [Seguir leyendo]

1. Una planta, o parte de la planta, plántula, tejido, célula, fracción subcelular, semilla, plantón, protoplasto, descendencia o descendiente recombinante, caracterizada (o) por que tiene una construcción de expresión que codifica una proteína modificada que comprende una proteína diana y una secuencia de inteína de la polimerasa de Pyrococcus spp. (pol Psp) variante que tiene una metionina en el resto de aminoácido 534, en el que la secuencia de inteína pol Psp variante se fusiona dentro de la proteína diana en una posición tal que la presencia de la inteína reduce sustancialmente la actividad de la proteína modificada, y donde la proteína diana es una proteína lignocelulósica degradante y la secuencia de inteína pol Psp variante es térmicamente inducible para producir el corte y empalme en cis de la proteína modificada por la planta, parte de la planta, plántula, tejido, célula, fracción subcelular, semilla, plantón, protoplasto, descendencia o descendiente recombinante que tiene una temperatura de 50 º C o mayor.

2. La planta, o parte de la planta, plántula, tejido, célula, fracción subcelular, semilla, plantón, protoplasto, descendencia o descendiente de la reivindicación 1, donde la construcción de expresión comprende, unidos operativamente entre sí, un primer segmento de ácido nucleico que codifica la proteína lignocelulósica degradante y un segundo segmento de ácido nucleico fusionado dentro del primer segmento de ácido nucleico y que codifica la secuencia de inteína pol Psp variante, y opcionalmente un tercer segmento de ácido nucleico que codifica un marcador de selección o un gen indicador y/o un promotor.

3. La planta, o parte de la planta, plántula, tejido, célula, fracción subcelular, semilla, plantón, protoplasto, descendencia o descendiente de la reivindicación 1, donde la proteína modificada se expresa constitutivamente.

4. La planta, o parte de la planta, plántula, tejido, célula, fracción subcelular, semilla, plantón, protoplasto, 25 descendencia o descendiente de la reivindicación 1, que expresa de manera inductiva la proteína modificada.

5. La planta, o parte de la planta, plántula, tejido, célula, fracción subcelular, semilla, plantón, protoplasto, descendencia o descendiente de la reivindicación 1, donde la proteína modificada se expresa en un punto predeterminado del ciclo de la vida de la planta; en al menos un tejido específico o parte del mismo; y/o en al menos un compartimento subcelular específico; y/o se expresa y se secreta extracelularmente.

6. La planta, o parte de la planta, plántula, tejido, célula, fracción subcelular, semilla, plantón, protoplasto, descendencia o descendiente de la reivindicación 2, donde el a menos un marcador de selección confiere resistencia a un producto químico seleccionado del grupo que consiste en bromoxinil, ácido 2, 2-dicloropropiónico, G418, glifosato, haloxifop, higromicina, imidazolina, kanamicina, metotrexato, neomicina, manosa, fosfinotricina, setoxidim, tricoteceno, sulfonilurea, s-triacina y/o triazolopirimidina; y/o el promotor está presente y precede al primer ácido nucleico.

7. La planta, o parte de la planta, plántula, tejido, célula, fracción subcelular, semilla, plantón, protoplasto, descendencia o descendiente de la reivindicación 6, que es tolerante o resistente a niveles normalmente tóxicos de al menos un producto químico.

8. La planta, o parte de la planta, plántula, tejido, célula, fracción subcelular, semilla, plantón, protoplasto, descendencia o descendiente de la reivindicación 2, donde la planta, o parte de la planta, plántula, tejido, célula, semilla, plantón, protoplasto, descendencia o descendiente es fértil y los primer y segundo segmentos de ácido nucleico son hereditarios.

9. La planta, o parte de la planta, plántula, tejido, célula, fracción subcelular, semilla, plantón, protoplasto, descendencia o descendiente de la reivindicación 1, donde la planta no es fértil.

10. Una planta, o parte de la planta, plántula, tejido, célula, fracción subcelular, semilla, plantón, protoplasto,

descendencia o descendiente recombinante de la reivindicación 1 genéticamente endogámica (o) , caracterizada (o) por que tiene una construcción de expresión con las características de la construcción de expresión de la reivindicación 1.

11. Un híbrido genético de la planta, o de parte de la planta, de la plántula, del tejido, de la célula, de la fracción subcelular, de la semilla, del plantón, del protoplasto, de la descendencia o del descendiente recombinante de la reivindicación 1, caracterizado por que tiene una construcción de expresión con las características de la construcción de expresión de la reivindicación 1.

12. La planta, o parte de la planta, plántula, tejido, célula, fracción subcelular, semilla, plantón, protoplasto,

descendencia o descendiente de la reivindicación 1, donde la secuencia de inteína pol Psp variante y la proteína lignocelulósica degradante tienen una primera unión de corte y empalme aguas arriba de la secuencia de inteína pol

Psp variante y una segunda unión de corte y empalme aguas abajo de la secuencia de inteína pol Psp variante, una parte C-exteína de la proteína lignocelulósica degradante aguas abajo de la secuencia de inteína pol Psp variante y una parte N-exteína de la proteína lignocelulósica degradante aguas arriba de la secuencia de inteína pol Psp variante y donde el resto de aminoácido en el extremo carboxilo de una de las uniones de corte y empalme comprende un resto de aminoácido provisto de una cadena lateral hidroxilo o sulfihidrilo.

13. La planta, o parte de la planta, plántula, tejido, célula, fracción subcelular, semilla, plantón, protoplasto, descendencia o descendiente de la reivindicación 1, donde la secuencia de inteína pol Psp variante y la proteína lignocelulósica degradante tienen una primera unión de corte y empalme aguas arriba de la secuencia de inteína pol Psp variante y una segunda unión de corte y empalme aguas abajo de la secuencia de inteína pol Psp variante, una parte C-exteína de la proteína lignocelulósica degradante aguas abajo de la secuencia de inteína pol Psp variante y una parte N-exteína de la proteína lignocelulósica degradante aguas arriba de la secuencia de inteína pol Psp variante y donde el resto de aminoácido en la segunda unión de corte y empalme comprende un resto de aminoácido en el extremo amino de la C-exteína que carece de una cadena lateral hidroxilo o sulfihidrilo.

14. La planta, o parte de la planta, plántula, tejido, célula, fracción subcelular, semilla, plantón, protoplasto, descendencia o descendiente de la reivindicación 1, donde la secuencia de inteína pol Psp variante y la proteína lignocelulósica degradante tienen una primera unión de corte y empalme aguas arriba de la secuencia de inteína pol Psp variante y una segunda unión de corte y empalme aguas abajo de la secuencia de inteína pol Psp variante, una parte C-exteína de la proteína lignocelulósica degradante aguas abajo de la secuencia de inteína pol Psp variante y una parte N-exteína de la proteína lignocelulósica degradante aguas arriba de la secuencia de inteína pol Psp variante y donde el extremo amino de la secuencia de inteína pol Psp variante comprende un resto de aminoácido provisto de una cadena lateral hidroxilo o sulfihidrilo.

15. La planta, o parte de la planta, plántula, tejido, célula, fracción subcelular, semilla, plantón, protoplasto, descendencia o descendiente de la reivindicación 1, donde la secuencia de inteína pol Psp variante y la proteína lignocelulósica degradante tiene una primera unión de corte y empalme aguas arriba de la secuencia de inteína pol Psp variante y una segunda unión de corte y empalme aguas abajo de la secuencia de inteína pol Psp variante, una parte C-exteína de la proteína lignocelulósica degradante aguas abajo de la secuencia de inteína pol Psp variante y una parte N-exteína de la proteína lignocelulósica degradante aguas arriba de la secuencia de inteína pol Psp variante y donde la primera unión de corte y empalme comprende una cisteína.

16. La planta, o parte de la planta, plántula, tejido, célula, fracción subcelular, semilla, plantón, protoplasto, descendencia o descendiente de la reivindicación 1, donde la secuencia de inteína pol Psp variante y la proteína lignocelulósica degradante tienen una primera unión de corte y empalme aguas arriba de la secuencia de inteína pol Psp variante y una segunda unión de corte y empalme aguas abajo de la secuencia de inteína pol Psp variante, una parte C-exteína de la proteína lignocelulósica degradante aguas abajo de la secuencia de inteína pol Psp variante y una parte N-exteína de la proteína lignocelulósica degradante aguas arriba de la secuencia de inteína pol Psp variante y donde la segunda unión de corte y empalme comprende His-Asn en el extremo carboxilo de la secuencia de inteína pol Psp variante, y un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral hidroxilo o sulfihidrilo en el extremo amino de la C-exteína.

17. La planta, o parte de la planta, plántula, tejido, célula, fracción subcelular, semilla, plantón, protoplasto, descendencia o descendiente de la reivindicación 1, donde la secuencia de inteína pol Psp variante y la proteína 45 lignocelulósica degradante tienen una primera unión de corte y empalme aguas arriba de la secuencia de inteína pol Psp variante y una segunda unión de corte y empalme aguas abajo de la secuencia de inteína pol Psp variante, una parte C-exteína de la proteína lignocelulósica degradante aguas abajo de la secuencia de inteína pol Psp variante y una parte N-exteína de la proteína lignocelulósica degradante aguas arriba de la secuencia de inteína pol Psp variante y donde la segunda unión de corte y empalme comprende Asp en el extremo carboxilo de la secuencia de inteína pol Psp variante y un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral hidroxilo o sulfihidrilo en el extremo amino de la C-exteína.

18. La planta, o parte de la planta, plántula, tejido, célula, fracción subcelular, semilla, plantón, protoplasto, descendencia o descendiente de la reivindicación 17, donde la Asp del extremo carboxilo se reemplaza por un 55 aminoácido que carece de una cadena lateral carboxilo o amino.

19. La planta, o parte de la planta, plántula, tejido, célula, fracción subcelular, semilla, plantón, protoplasto, descendencia o descendiente de la reivindicación 1, donde la secuencia de inteína pol Psp variante se inserta inmediatamente antes de Ser, Thr o Cys de la proteína lignocelulósica degradante.

20. La planta, o parte de la planta, plántula, tejido, célula, fracción subcelular, semilla, plantón, protoplasto, descendencia o descendiente de la reivindicación 1, donde el extremo amino o carboxilo de la inteína pol Psp variante comprende Ser, Thr o Cys.

21. La planta, o parte de la planta, plántula, tejido, célula, fracción subcelular, semilla, plantón, protoplasto, descendencia o descendiente de la reivindicación 1, donde la proteína lignocelulósica degradante es nativa en un

microorganismo.

22. Un método para producir una planta, o una parte de la planta, una plántula, un tejido, una célula, una fracción subcelular, una semilla, un plantón, o un protoplasto transformado recombinante caracterizado por que tiene una construcción de expresión que codifica una proteína modificada que comprende una proteína diana y una secuencia de inteína pol Psp variante que tiene una metionina en el resto de aminoácido 534, y donde la secuencia de inteína pol Psp variante se fusiona dentro de la proteína diana en una posición tal que la presencia de la inteína reduce sustancialmente la actividad de la proteína modificada, y donde la proteína diana es una proteína lignocelulósica degradante y la secuencia de inteína pol Psp variante es térmicamente inducible para producir el corte y empalme en cis de la proteína modificada por tener una temperatura de 50 º C o mayor, comprendiendo el método:

proporcionar la construcción de expresión; transformar una planta, o parte de la planta, plántula, tejido, célula, fracción subcelular, semilla, plantón o protoplasto, con la construcción de expresión; y seleccionar la planta, o parte de la planta, plántula, tejido, célula, fracción subcelular, semilla, plantón, o protoplasto recombinante transformado (a) , y de este modo producir la planta, o parte de la planta, plántula, tejido, célula, fracción subcelular, semilla, plantón o protoplasto recombinante transformado (a) .

23. El método de la reivindicación 22, donde la etapa de transformación comprende una transformación estable.

24. El método de la reivindicación 22, donde la construcción de expresión comprende al menos uno de un promotor, un marcador de selección, un marcador de resistencia, un marcador hereditario, una secuencia de poliadenilación, un represor, un potenciador, una secuencia de localización, o una secuencia de señalización.

25. El método de la reivindicación 22, donde la etapa de transformación incluye al menos uno de una transformación viral, un bombardeo con microproyectiles cubiertos con ADN, una transformación génica liposomal, una transferencia génica bacteriana, una electroporación o una transformación génica química.

26. El método de la reivindicación 22, donde la selección de la planta, o de parte de la planta, plántula, tejido, célula, fracción subcelular, semilla, plantón o protoplasto transformado recombinante se facilita por al menos uno de un marcador de selección o un marcador de resistencia.

27. El método de la reivindicación 22, donde la planta transformada recombinante se regenera a partir de uno de un tejido embrionario transformado;

de protoplastos de planta; de células derivadas de embriones inmaduros; o de semillas transformadas.

28. Un método para producir una semilla que exprese una proteína modificada que comprenda una proteína diana y una secuencia de inteína pol Psp variante que tenga una metionina en el resto de aminoácido 534, donde la secuencia de inteína pol Psp variante se fusione dentro de la proteína diana en una posición tal que la presencia de la inteína reduzca sustancialmente la actividad de la proteína modificada y donde la proteína diana es una proteína lignocelulósica degradante y la secuencia de inteína pol Psp variante es térmicamente inducible para producir un corte y empalme en cis de la proteína modificada por tener una temperatura de 50 º C o mayor, que comprende 45 producir una planta, o una parte de la planta, plántula, tejido, célula, fracción subcelular, semilla, plantón, protoplasto, descendencia o descendiente transformado recombinante mediante el método de una cualquiera de las reivindicacione.

2. 27; poner en cultivo o cultivar la planta, o la parte de la planta, plántula, tejido, célula, fracción subcelular, semilla, plantón, protoplasto, descendencia o descendiente recombinante transformado; y obtener a partir de esto, una semilla que exprese la proteína modificada.

29. Un método para producir una proteína modificada que comprende una proteína diana y una secuencia de inteína pol Psp variante que tiene una metionina en el resto de aminoácido 534, donde la secuencia de inteína pol Psp variante se fusiona dentro de la proteína diana en una posición tal que la presencia de la inteína reduce 55 sustancialmente la actividad de la proteína modificada, y donde la proteína diana es una proteína lignocelulósica degradante y la secuencia de inteína pol Psp variante es térmicamente inducible para producir un corte y empalme en cis de la proteína modificada por tener una temperatura de 50 º C o mayor, a partir de una planta, o de una parte de la planta, plántula, tejido, célula, fracción subcelular, semilla, plantón, protoplasto, descendencia o descendiente transformado que exprese la proteína modificada que comprende realizar el método de una cualquiera de las reivindicacione.

2. 28; recoger la proteína modificada de la planta, o parte de la planta, plántula, tejido, célula, fracción subcelular, semilla, plantón, protoplasto, descendencia o descendiente transformado; y purificar opcionalmente la proteína modificada.

30. Un método para producir una proteína modificada que comprende una proteína lignocelulósica degradante y una secuencia de inteína pol Psp variante que tiene una metionina en el resto de aminoácido 534, donde la secuencia de

inteína pol Psp variante se fusiona dentro de la proteína diana en una posición tal que la presencia de la inteína reduce sustancialmente la actividad de la proteína modificada y donde la proteína diana es una proteína lignocelulósica degradante y la secuencia de inteína pol Psp variante es térmicamente inducible para producir un corte y empalme en cis de la proteína modificada por tener una temperatura de 50 º C o mayor, que comprende proporcionar la planta, o la parte de la planta, plántula, tejido, célula, fracción subcelular, semilla, plantón, protoplasto, descendencia o descendiente recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-21; y cultivar la planta, o la parte de la planta, plántula, tejido, célula, fracción subcelular, semilla, plantón, protoplasto, descendencia o descendiente recombinante en condiciones eficaces para expresar la proteína modificada.