Sistemas y métodos para expresión clonales en plantas.

Un linaje de raíz clonal, linaje de células de raíz clonal, linaje de células de plantas clonales,

o plantas clonales derivado(a) de una planta o porción de la misma, en donde una célula del linaje de raíz clonal, linaje de células de raíz clonal, linaje de células de plantas clonales, o plantas clonales comprende de manera estable:

(i) un vector de RNA viral autorreplicante, episómico y extracromosómico que comprende un polinucleótido de interés que no está asociado normalmente con las secuencias del vector viral; y

(ii) un DNA de Ri o porción del mismo suficiente para generar raíces pilosas; en donde las células del linaje de raíz clonal, linaje de células de raíz clonal, linaje de células de plantas clonales, o plantas clonales se originan a partir de una célula que se infectó con el vector de RNA viral antes de la introducción del T-DNA de Ri o porción del mismo, y en donde el linaje de raíz clonal, el linaje de células de raíz clonal, el linaje de células de plantas clonales, o la plantas clonales expresa el polinucleótido de interés.

Sistemas y métodos para expresión clónales en plantas.

Remisión a una Solicitud Afín

Esta solicitud reivindica prioridad para y el beneficio de la Solicitud Provisional de Patente U.S. No. 6/546339 presentada el 2 de febrero de 24.

Antecedentes de la Invención

La investigación para identificar moléculas con potencial para uso preventivo y terapéutico (anticuerpos, enzimas, hormonas y antígenos de vacuna) es de importancia primordial para la salud y la medicina. Históricamente, muchas de estas moléculas se recuperaron de fuentes humanas o animales. Sin embargo, las bajas cantidades de producto diana en el material originario asociadas con costes enormes, y lo que es más importante, la seguridad, han limitado la disponibilidad de principios terapéuticos y vacunas para prevención y tratamiento de muchas enfermedades en todo el mundo.

A mediados de los años 197, la tecnología del DNA recombinante revolucionó el proceso e hizo posible la producción de moléculas diana predominantemente en sistemas de expresión bacterianos. Aunque los sistemas de expresión procariotas continúan siendo un método ampliamente utilizado para producción de proteínas recombinantes, esta plataforma tiene sus limitaciones debido, por ejemplo, a la ausencia de modificaciones posteriores a la traducción en eucariotas y el plegado inadecuado de muchas proteínas humanas complejas. Durante las tres últimas décadas muchos laboratorios de investigación han enfocado sus intereses en el desarrollo de sistemas alternativos para expresión de proteínas recombinantes que pudieran contrarrestar los inconvenientes de los sistemas bacterianos. Resultantes de estos estudios fueron los sistemas de cultivo de células animales y de insectos. Aunque cierto número de productos tales como anticuerpos monoclonales, vacunas y principios terapéuticos se han producido utilizando estos sistemas, sin embargo el elevado coste de producción combinado con el requerimiento de instalaciones de fabricación sumamente complejas para cada proteína diana motivó la investigación de sistemas de producción diferentes.

En los últimos años, se han utilizado cada vez más las plantas como sistema hospedador para la expresión de proteínas recombinantes. Dicha expresión puede realizarse, por ejemplo, sea por integración del gen de interés en un genoma de planta, para crear una planta transgénica que exprese de manera estable la proteína deseada, o por introducción del gen de interés en un vector de planta que pueda ser introducido en células de plantas, y mantenido transitoriamente en ellas. Los sistemas de vectores virales han demostrado ser particularmente útiles.

Sin embargo, persiste la necesidad de desarrollar sistemas mejorados para la expresión de una molécula de interés en plantas. Por ejemplo, los virus pueden infectar plantas distintas de la diana, planteando potencialmente riesgos ambientales importantes. Asimismo, muchos virus de plantas disponibles manipulados genéticamente no expresan genes insertados a los niveles deseados, y/o en las plantas o tejidos diana deseados. Adicionalmente, una desventaja con diversos sistemas vectores virales existentes es que la estabilidad del virus puede ser problemática. En general, existe necesidad en la técnica de sistemas de expresión en plantas que pudieran permitir mayores flexibilidad y control.

Sumario de la Invención

La presente invención abarca el reconocimiento de que la disponibilidad de sistemas de expresión clónales para plantas podría ofrecer numerosas ventajas importantes. La invención proporciona métodos y reactivos para generar una diversidad de entidades clónales derivadas de plantas. Estas entidades clónales incluyen linajes de raíz clónales, linajes de células de raíces clónales, linajes de células de plantas clónales, y plantas clónales. La invención proporciona además métodos y reactivos para expresión de productos polinucleotídicos y polipeptídicos en linajes de células clónales derivados de diversos tejidos de plantas (v.g. raíces, hojas), y en plantas enteras derivadas de células simples (plantas clónales). Los métodos están basados en el uso de vectores virales de plantas de diversos tipos. La invención es como se expone en las reivindicaciones.

Por ejemplo, en un aspecto, la invención proporciona un método de obtención de un linaje de raíces clónales que expresa un polinucleótido de interés que comprende pasos de: (i) introducir un vector viral que comprende un polinucleótido de interés en una planta o porción de la misma; y (ii) generar una o más linajes de raíz clónales de la planta. Los linajes de raíz clónales pueden generarse, por ejemplo, por infección de la planta o porción de la planta (v.g., una pieza de hoja cosechada) con un Agrobacterium (v.g., A. rhizogenes) que causa la formación de raíces pilosas. Los linajes de raíz clónales pueden cribarse de diversas maneras para identificar linajes que mantienen el virus, linajes que expresan el polinucleótido de interés a niveles altos, etc. La invención proporciona además linajes de raíz clónales, v.g. linajes de raíz clónales producidos conforme a los métodos de inventiva y abarca adicionalmente métodos de expresión de polinucleótidos y producción de polipéptidos de interés que utilizan los linajes de raíces clónales.

La invención proporciona además un método de regeneración de un linaje de células de raíces clónales que expresan un pollnucleótido de interés que comprende pasos de: (i) generar un linaje de raíces clónales, cuyas células contienen un vector viral cuyo genoma comprende un polinucleótido de interés; (ii) liberar células individuales del linaje de raíces clónales; y (iii) mantener las células en condiciones adecuadas para proliferación de las células de raíz. La invención proporciona linajes de células de raíces clónales y métodos de expresión de polinucleótidos y producción de polipéptidos que utilizan los linajes de células de raíces clónales.

En otro aspecto, la invención proporciona un método de generación de un linaje de células de plantas clónales que expresan un polinucleótido de interés que comprende pasos de: (i) generar un linaje de raíces clónales, cuyas células contienen un vector viral cuyo genoma comprende un polinucleótido de interés; (ii) liberar células individuales del linaje de raíces clónales; y (iii) mantener las células en cultivo en condiciones apropiadas para proliferación de las células de la planta. La invención proporciona además un método de generación de un linaje de células de plantas clónales que expresan un polinucleótido de interés que comprende pasos de: (i) introducción de un vector viral que comprende un polinucleótido de interés en células de un linaje de células de plantas mantenidas en cultivo; y (¡i) enriquecimiento de las células que contienen el vector viral. El enriquecimiento puede realizarse, por ejemplo por (i) eliminación de una porción de las células del cultivo; (ii) dilución de las células eliminadas a fin de reducir la concentración de las células; (iii) permisión de proliferación de las células diluidas; y (iv) cribado para células que contengan el vector viral. Los linajes de células de plantas clónales pueden utilizarse para producción del polipéptido de interés.

La invención caracteriza varios métodos para generación de plantas clónales, cuyas células contienen un vector viral que comprende un polinucleótido de Interés. Por ejemplo, la invención proporciona un método de regeneración de una plantas clónales que expresa un polinucleótido de Interés que comprende pasos de: (i) generar un linaje de raíces clónales, cuyas células contienen un vector viral cuyo genoma comprende un polipéptido de Interés; (¡i) liberar células individuales a partir del linaje de raíces clónales; y (¡II) plantar las células en condiciones apropiadas para formación de una planta. La Invención proporciona adlclonalmente un método de generación de una plantas clónales que expresa un polinucleótido de Interés que comprende pasos de: (I) generar un linaje de células de plantas clónales, cuyas células contienen un vector viral cuyo genoma comprende un polinucleótido de interés; y (ii) mantener las células en cultivos apropiados para formación de una planta. En general, las plantas clónales pueden expresar cualquier polinucleótido de Interés. Las plantas clónales pueden utilizarse para producción de un polipéptido de interés.

Esta solicitud se refiere a diversas patentes, solicitudes de patente, y publicaciones, que incluyen Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols in Immunology, Current Protocols in Protein Science, y Current Protocols ¡n Cell Biology, todas... [Seguir leyendo]

1. Un linaje de raíz clonal, linaje de células de raíz clonal, linaje de células de plantas clónales, o plantas clónales derlvado(a) de una planta o porción de la misma, en donde una célula del linaje de raíz clonal, linaje de células de raíz clonal, linaje de células de plantas clónales, o plantas clónales comprende de manera estable:

(i) un vector de RNA viral autorreplicante, eplsómlco y extracromosómlco que comprende un pollnucleótldo de interés que no está asociado normalmente con las secuencias del vector viral; y

(ii) un DNA de R¡ o porción del mismo suficiente para generar raíces pilosas; en donde las células del linaje de raíz clonal, linaje de células de raíz clonal, linaje de células de plantas clónales, o plantas clónales se originan a partir de una célula que se Infectó con el vector de RNA viral antes de la Introducción del T-DNA de R¡ o porción del mismo, y en donde el linaje de raíz clonal, el linaje de células de raíz clonal, el linaje de células de plantas clónales, o la plantas clónales expresa el pollnucleótldo de Interés.

2. El linaje de raíz clonal, linaje de células de raíz clonal, linaje de células de plantas clónales, o la plantas clónales de la reivindicación 1, en donde el vector viral se deriva de TMV o AIMV.

3. El linaje de raíz clonal, linaje de células de raíz clonal, linaje de células de plantas clónales, o la plantas clónales de la reivindicación 1, en donde el pollnucleótldo de interés está enlazado operativamente a un promotor CP, un promotor MP, un promotor ¡nduclble, o un promotor activable en trans.

4. Un método de obtención de un linaje de raíz clonal, linaje de células de raíz clonal, linaje de células de plantas clónales, o plantas clónales que expresa un pollnucleótldo de interés, que comprende pasos de:

(i) introducción de un vector de RNA viral autorreplicante, episómico y extracromosómico que comprende el polinucleótido de interés en una planta o porción de la misma, en donde el polinucleótido de Interés no está asociado naturalmente con las secuencias del vector viral; y subsiguientemente

(¡i) introducción en la planta o porción de la misma de un DNA de Ri o porción del mismo suficiente para generar raíces pilosas, generando así uno o más linajes de raíz clonal, linajes de células de raíz clonal, linajes de células de plantas clónales, o plantas clónales a partir de la planta o porción de la misma; y

(iii) cribado de uno o más de los linajes de raíz clonal, linajes de células de raíz clonal, linajes de células de plantas clónales, o plantas clónales para expresión del polinucleótido de interés; y

(iv) selección de un linaje de raíz clonal, linaje de células de raíz clonal, linaje de células de plantas clónales, o plantas clónales que exhibe expresión del polinucleótido de interés, en donde una célula del linaje de raíz clonal, linaje de células de raíz clonal, linaje de células de plantas clónales, o la plantas clónales selecclonado(a) comprende de manera estable el vector de RNA viral auto-replicante, episómico y extracromosómlco y el T-DNA de Ri.

5. El método de la reivindicación 4, en donde el paso (ii) comprende poner en contacto la planta o porción de la misma con Agrobacteríum rhizogenes.

6. El método de la reivindicación 4, en donde el vector viral se deriva de TMV o AIMV.

7. El método de la reivindicación 4, en donde el vector viral carece de secuencias codificantes de una proteína

de la cubierta funcional, proteína de movimiento funcional, o ambas.

8. El método de la reivindicación 4, en donde el polinucleótido de Interés está enlazado operativamente a un promotor CP, un promotor MP o un promotor ¡nduclble.

9. El método de la reivindicación 4, en donde el vector viral comprende un pollnucleótldo que codifica un marcador detectable o seleccionable.

1. El método de la reivindicación 4, que comprende adicionalmente el paso de mantener la planta o porción de

la misma que contiene el vector viral durante un periodo de tiempo después de la Introducción del vector viral y antes

de la introducción del T-DNA de Ri para permitir la replicación del vector viral.

11. El método de la reivindicación 4, que comprende adicionalmente pasos de: liberación de células individuales a partir de una raíz clonal generada en el paso (¡I); y

mantenimiento de las células liberadas en cultivo en condiciones apropiadas para la proliferación de células de plantas.

12. El método de la reivindicación 11, en donde la proliferación de células de plantas es proliferación de células de raíz.

13. El método de la reivindicación 4, que comprende adicionalmente pasos de: liberación de células Individuales a partir de una raíz clonal generada en el paso (¡i); y mantenimiento de las células liberadas en condiciones apropiadas para la formación de una planta.

14. Un método de producción de un polinucleótido o polipéptido, que comprende pasos de: i) mantenimiento de un linaje de raíz clonal, linaje de células de raíz clonal, o linaje de células de plantas clónales obtenido utilizando el método conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 12 en cultivo, o crecimiento de una plata clonal obtenida utilizando el método conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 1 y 13;

(ii) cosecha de las células o medio de cultivo del linaje de raíz clonal, linaje de células de raíz clonal, o linaje de células de plantas clónales, o cosecha del tejido de la planta clonal; y

(i¡¡) aislamiento o purificación del polinucleótido o polipéptido a partir de las células, medio de cultivo, o tejido cosechados.

15. El método de la reivindicación 14, en donde el linaje de raíz clonal, linaje de células de raíz clonal, o linaje de

células de plantas clónales es un linaje de raíz clonal.

16. El método de la reivindicación 14, que comprende: mantenimiento en cultivo del linaje de raíz clonal;

cosecha del tejido de raíz o medio de cultivo del linaje de raíz clonal; y aislamiento o purificación del polipéptido de interés a partir del tejido de raíz o medio de cultivo cosechado.

17. El método de la reivindicación 14, que comprende:

mantenimiento en cultivo del linaje de células de raíz clonal o linaje de células de planta clonal;

cosecha de las células o medio de cultivo a partir del linaje de raíz clonal o linaje de planta clonal; y

aislamiento o purificación del polipéptido de Interés a partir de las células de raíz cosechadas o medio de cultivo.

18. El método de la reivindicación 14, que comprende: crecimiento de la planta clonal;

cosecha del tejido de planta a partir de la planta clonal; y

aislamiento o purificación del polipéptido de Interés a partir del tejido de planta cosechado.