OBTENCIÓN DE CÉLULAS TR1 ESPECÍFICAS DE ANTÍGENOS DE LOS ALIMENTOS O DE AUTOANTÍGENOS A PARTIR DE UNA POBLACIÓN DE LEUCOCITOS O PBMC.

Obtención de células Tr1 específicas de antígenos de los alimentos o de autoantígenos a partir de una población de leucocitos o PBMC. La invención se refiere a un método in vitro para la obtención de una población de células Tr1 específicas de antígenos de los alimentos o de autoantígenos de una población de leucocitos o PBMC, que comprende estimular la población de leucocitos o PBMC con el antígeno de alimentos o el autoantígeno, y recuperar la población de células Tr1 específicas del antígeno de los alimentos o el autoantígeno de la población de células estimuladas. Preferiblemente, la población de PBMC o leucocitos se vuelve a estimular por lo menos una vez con el mismo antígeno después de la etapa (1), en presencia de IL-2 y por lo menos una interleucina seleccionada entre IL-4 o IL- 13. El método in vitro puede además comprender una tercera etapa de expandir la población de células Tr1 específicas del antígeno recuperadas, ventajosamente poniéndolas en contacto con células alimentadoras capaces de expresar factores necesarios para dicha expansión. Preferiblemente, las células alimentadoras son células alimentadoras de insectos recombinantes. Entre las poblaciones de células T, existen ahora datos acumulativos de una subpoblación de células T diferente y con una nueva funcionalidad, denominadas células reguladoras Tr1 o células Tr1. Los inventores demostraron que las células T reguladoras 1 (Tr1) podrían utilizarse para tratar enfermedades inflamatorias (es decir, enfermedad de Crohn (H. Groux et al. Nature 1997, 389, 737-742), inflamación de la piel (Foussat et al. 2003 J. Immunol. 171, 5018- 5026), aterosclerosis (Mallat et al. Circulation 2003, 108, 1232-1237) o esclerosis múltiple (Barrat et al. 2002, 195, 603-616). En todos estos modelos, se demostró que las células Tr1 antinflamatorias se dirigían contra un antígeno específico y que era necesaria la administración de ese antígeno, preferentemente en el sitio de inflamación, para estimular las células Tr1 a que induzcan sus funciones antinflamatorias. Por lo tanto, con el fin de usar las células Tr1 para tratar enfermedades humanas, debe ser posible aislar células Tr1 específicas de antígenos. No obstante, se ha comprobado que esto es muy difícil. La solicitud de patente internacional WO 02/090357 describe la preparación de células Tr1 estimulando células T CD4 + con células L de ratón transfectadas con HLA-II DR1 y CD58 (LFA3), seleccionando células CD4 + CD25 + y expandiendo clones en presencia de IL-2 e IL-4. Los inventores también han demostrado que las células Tr1 expresan marcadores específicos de superficie y que podrían caracterizarse por la coexpresión de los marcadores CD3 y CD4 como también por la expresión de CD49b y un alto nivel de expresión de CD18, y, si corresponde, por la demostración de una expresión excesiva de genes que codifican las proteínas CD4, PSGL-1, PECAM-1 y alfaV/beta3 (véase la solicitud de patente internacional publicada con el número WO 2005/000344). Sorprendentemente, los inventores han observado que las células Tr1 purificadas aisladas de sangre humana basada en la expresión de estos marcadores (y en consecuencia las células Tr1 presentes en una población de PBMC o leucocitos) proliferaron vigorosamente en respuesta a antígenos de alimentos o autoantígenos, y que la respuesta proliferativa de estas células podría mantenerse con estimulación, usando IL-2 e IL-4 (IL para interleucina). Este potencial ofrece una importante ventaja frente a la técnica anterior, ya que de acuerdo con el conocimiento común del experto en la técnica, anteriormente era necesario aislar en primer lugar las células T vírgenes específicas de antígenos de una población de PBMC, en segundo lugar inducir la diferenciación de las células Tr1 específicas de antígenos, mientras que ahora es posible obtener células Tr1 específicas de antígenos de alimentos o autoantígenos directamente de una población de PBMC (o leucocitos). En la presente invención, el método in vitro para obtener células Tr1 específicas de antígenos de alimentos o autoantígenos se simplifica, y se aumenta la seguridad de los pacientes a quienes se les administran estas células, ya que estas células no se han modificado en términos de calidad. En consecuencia, el objeto de la presente invención es un método in vitro para obtener una población de células Tr1 específicas de antígenos de alimentos o autoantígenos de una población de leucocitos o una población de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), comprendiendo dicho método: 1) estimular la población de PBMC o leucocitos con el antígeno del alimento o el autoantígeno, 2) recuperar la población de células Tr1 específicas del antígeno del alimento o el autoantígeno de la población de células estimuladas, 3) expandir la población de células Tr1 específicas del antígeno recuperada en la etapa (2) en un medio de cultivo Mp, donde dicha etapa de expansión comprende: a) cultivar a una temperatura T1 en un medio de cultivo Mf, células alimentadoras capaces de expresar los factores del grupo (A) que comprenden - un anticuerpo anti-CD3 modificado, donde la modificación del anticuerpo anti-CD3 consiste en el reemplazo 2   del dominio intracitoplásmico anti-CD3 de la cadena pesada anti-CD3 con un dominio transmembrana, estando dicho anticuerpo anti-CD3 modificado anclado a la membrana celular de las células alimentadoras y siendo susceptible a interactuar con el complejo de proteínas CD3/TCR de las células T, o una de sus variantes, - la proteína CD80 o CD86, preferiblemente la proteína CD80, anclada a la membrana celular de las células alimentadoras, que es susceptible a interactuar con la proteína CD28 de las células T, o una de sus variantes, y - la proteína CD58 anclada a la membrana celular de las células alimentadoras, que es susceptible a interactuar con la proteína CD2 de las células Tr1, o una de sus variantes, - IL-2 segregada por las células alimentadoras, que es susceptible a interactuar con el receptor de IL-2 de las células Tr1, o una de sus variantes, y - una interleucina seleccionada de IL-4 o interleucina 13 (IL-13), preferiblemente IL-4, siendo dicha interleucina segregada por las células alimentadoras y susceptible a interactuar con el receptor de IL-4 de las células Tr1, o una de sus variantes, permitiendo dicha temperatura T1 la proliferación de dichas células alimentadoras, b) poner en contacto las células alimentadoras obtenidas en la etapa (a) depuradas o no de su medio de cultivo Mf, con la población de células Tr1 específicas de antígenos contenida en el medio de cultivo Mp, donde dicho medio de cultivo Mp no contiene inicialmente dicho grupo de factores que comprenden, con el fin de obtener una mezcla que contenga la población de células Tr1 específicas de antígenos, células alimentadoras y el medio de cultivo Mp, c) cultivar la mezcla obtenida en la etapa (b) que contiene los factores del grupo que son expresados por las células alimentadoras en el medio de cultivo Mp, donde dicha etapa (c) de cultivar se lleva a cabo a una temperatura T2 que es de por lo menos aproximadamente 35°C, de forma tal que: - la población de células Tr1 específicas de antígenos prolifera, y - las células alimentadoras no proliferan, y donde la población de células Tr1 específicas de antígenos se expande, d) recuperar la población de células Tr1 específicas de antígenos. Los leucocitos abarcan varios tipos de células que se caracterizan por su importancia, su distribución, su número, su vida útil y su potencialidad. Estos tipos son los siguientes: los leucocitos polinucleares o granulares, entre los cuales se encuentran los leucocitos eosinofílicos, neutrofílicos y basofílicos, y las células mononucleares, o células mononucleares de sangre periférica (PBMC),que son grandes glóbulos blancos y consisten en los tipos celulares del sistema inmunitario (linfocitos y monocitos). Los leucocitos o las PBMC pueden separarse de la sangre periférica a través de un método conocido por los expertos en la técnica. Ventajosamente, para la separación de las PBMC, se puede usar centrifugación, preferiblemente la centrifugación en gradiente de densidad, preferiblemente la centrifugación en gradiente de densidad discontinua. Una alternativa es el uso de anticuerpos monoclonales específicos. En determinadas realizaciones, las PBMC se aíslan típicamente del hemoderivado de sangre completa mediante Ficoll-Hypaque, usando procedimientos estándar. En otras realizaciones, las PBMC se recuperan mediante leucocitaféresis. El término "antígeno" en la expresión "población de células Tr1 específicas de antígeno" se refiere a un péptido inmunogénico. Los péptidos inmunogénicos son péptidos que se unen a moléculas del complejo de histocompatibilidad mayor... [Seguir leyendo]

1. Un método in vitro para la obtención de una población de células Tr1 específicas de antígenos de alimentos o autoantígenos proveniente de una población de leucocitos o de una población de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), comprendiendo dicho método: 1) estimular la población de PBMC o leucocitos con el antígeno de alimentos o el autoantígeno, 2) recuperar la población de células Tr1 específicas de antígenos de alimentos o autoantígenos de la población de células estimuladas, 3) expandir la población de células Tr1 específicas de antígenos de alimentos o autoantígenos recuperada en la etapa (2) en un medio de cultivo Mp, donde dicha etapa de expansión comprende: a) cultivar a una temperatura T1 en un medio de cultivo Mf, células alimentadoras capaces de expresar los factores del grupo (A) que comprenden: - un anticuerpo anti-CD3 modificado, donde la modificación del anticuerpo anti-CD3 consiste en el reemplazo del dominio intracitoplásmico anti-CD3 de la cadena pesada anti-CD3 con un dominio transmembrana, estando dicho anticuerpo anti-CD3 modificado anclado a la membrana celular de las células alimentadoras y siendo susceptible a interactuar con el complejo de proteínas CD3/TCR de las células T, - la proteína CD80 o CD86, preferiblemente la proteína CD80, anclada a la membrana celular de las células alimentadoras, que es susceptible a interactuar con la proteína CD28 de las células T, y - la proteína CD58 anclada a la membrana celular de las células alimentadoras, que es susceptible a interactuar con la proteína CD2 de las células Tr1, - IL-2 segregada por las células alimentadoras, que es susceptible a interactuar con el receptor de IL-2 de las células Tr1, y - una interleucina seleccionada entre IL-4 o interleucina 13 (IL-13), preferiblemente IL-4, siendo dicha interleucina segregada por las células alimentadoras y siendo susceptible a interactuar con el receptor de IL- 4 de las células Tr1, de modo que T1 permita la proliferación de dichas células alimentadoras, b) poner en contacto las células alimentadoras obtenidas en la etapa (a) depuradas o no de su medio de cultivo Mf, con la población de células Tr1 específicas de antígenos contenida en el medio de cultivo Mp, donde dicho medio de cultivo Mp no contiene inicialmente dicho grupo (A) de factores con el fin de obtener una mezcla que contenga la población de células Tr1 específicas de antígenos, las células alimentadoras y el medio de cultivo Mp, c) cultivar la mezcla obtenida en la etapa (b) que contiene los factores del grupo (A) que son expresados por las células alimentadoras en el medio de cultivo Mp, donde dicha etapa (c) de cultivar se lleva a cabo a una temperatura T2 que es por lo menos aproximadamente 35°C, de modo tal que: - la población de células Tr1 específicas de antígenos prolifera, y - las células alimentadoras no proliferan, y donde la población de células Tr1 específicas de antígenos se expande, d) recuperar la población de células Tr1 específicas de antígenos así expandida. 2. El método según la reivindicación 1, en el que la población de células Tr1 específicas de antígenos de alimentos o autoantígenos se obtiene a partir de una población de PBMC. 3. El método según la reivindicación 1 o 2, en el que la población de PBMC o leucocitos se vuelve a estimular por lo menos una vez con el mismo antígeno después de la etapa (1), en presencia de interleucina-2 (IL-2) y por lo menos una interleucina seleccionada entre interleucina 4 (IL-4) o interleucina 13 (IL-13). 4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el antígeno de alimentos o el autoantígeno es un antígeno recombinante o sintetizado. 5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el antígeno de alimentos se selecciona entre ovalbúmina, caseína, proteína de soja, sus fragmentos, sus variantes o sus mezclas. 6. El método según la reivindicación 5, en el que el antígeno de alimentos se selecciona entre ovalbúmina de huevo 31   de pollo de la secuencia SEQ ID Nº23, alfa S1-caseína bovina de la secuencia SEQ ID Nº24, beta-caseína bovina de la secuencia SEQ ID Nº25, secuencias que tienen por lo menos 70% de identidad con una de las secuencias SEQ ID Nº23, SEQ ID Nº24 y SEQ ID Nº25. 7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el autoantígeno se selecciona entre insulina, proteína básica de mielina, sus fragmentos, sus variantes o sus mezclas. 8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en el que la población de PBMC estimulada en la etapa (1) contiene entre 0,01,10 6 y 100,10 6 células/mL, preferiblemente entre 10 6 y 2,10 6 células/mL. 9. El método según la reivindicación 8, en el que el antígeno de alimentos o el autoantígeno utilizado para estimulación de la población de PBMC en la etapa (1) está en forma soluble de 0,1 µg/mL a 5 mg/mL, preferiblemente de 1 a 2000 µg/mL. 10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la población de PBMC o leucocitos se incuba, antes de la estimulación de la etapa (1), con un marcador fluorescente de división celular que permite determinar, por citofluorometría, que cuando la intensidad de fluorescencia de la población celular estimulada es por lo menos inferior a la intensidad de fluorescencia de la población de PBMC o leucocitos, esa división celular ha ocurrido en dicha población de células estimuladas, y que dicha población de células estimuladas que es recuperada en la etapa (2) comprende la población de células Tr1 específicas de antígenos. 11. El método según la reivindicación 10, en el que el marcador fluorescente de división celular es el marcador de carboxifluoresceína diacetato succinimidil éster (CFSE), el marcador diacetato de ácido carboxílico Oregon green 488 (Carboxi-DFFDA SE) o el marcador PKH26. 12. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la población de células Tr1 específicas de antígenos se recupera en la etapa (2) por citofluorometría, usando anticuerpos marcados fluorescentes dirigidos contra proteínas presentes en la superficie de las células de dicha población de células Tr1 específicas de antígenos. 13. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la población de células Tr1 específicas de antígenos se recupera en la etapa (2) por una técnica de clonación, tal como ventajosamente dilución limitante. 14. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la población de PBMC o leucocitos es una población humana. 15. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que las células alimentadoras mueren durante la etapa (c). 16. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que en la etapa (d) se eliminan los fragmentos de membrana celular de las células alimentadoras que resultan de la muerte de dichas células. 17. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que las células alimentadoras son células recombinantes y contienen ácidos nucleicos heterólogos que codifican los factores del grupo (A). 18: El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que las células alimentadoras no tienen ninguna molécula del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) de clase I y/o II en su superficie. 19. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que en la etapa (b) las células alimentadoras son depuradas de su medio de cultivo Mf. 20. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en el que las células alimentadoras son células alimentadoras de insectos, siendo T1 inferior a T2. 21. El método según la reivindicación 20, en el que las células alimentadoras son de la línea celular de drosófila S2 depositada el 25 de marzo de 2005 en National Collection of Micro-organisms Cultures (CNCM) con el número 1- 3407. 22. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el que el medio de cultivo Mp es un medio de cultivo libre de suero. 23. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que el medio de cultivo Mf es un medio de cultivo libre de suero. 24. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en el que el dominio transmembrana que reemplaza al dominio intracitoplásmico de la cadena pesada del anticuerpo anti-CD3 es el domino transmembrana del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF). 25. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en el que los factores del grupo (A) son de origen humano. 32   26. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, en el que la cadena ligera del anticuerpo anti- CD3 modificado está codificada por el ácido nucleico heterólogo de la secuencia SEQ ID Nº1, o cualquier ácido nucleico que tenga por lo menos 70% de identidad con SED ID Nº1, y donde la cadena pesada del anticuerpo anti- CD3 modificado está codificada por ácido nucleico heterólogo de la secuencia SEQ ID Nº2, o cualquier ácido nucleico que tenga por lo menos 70% de identidad con SED ID Nº2. 27. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, en el que la proteína CD80 está codificada por el ácido nucleico heterólogo de la secuencia SEQ ID Nº3, o cualquier ácido nucleico que tenga por lo menos 70% de identidad con SED ID Nº3. 28. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, en el que la proteína CD86 está codificada por el ácido nucleico heterólogo de la secuencia SEQ ID Nº4, o cualquier ácido nucleico que tenga por lo menos 70% de identidad con SED ID Nº4. 29. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, en el que la proteína CD5 8 está codificada por el ácido nucleico heterólogo de la secuencia SEQ ID Nº6, o cualquier ácido nucleico que tenga por lo menos 70% de identidad con SED ID Nº6. 30. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, en el que la IL-2 está codificada por el ácido nucleico heterólogo de la secuencia SEQ ID Nº5, o cualquier ácido nucleico que tenga por lo menos 70% de identidad con SED ID Nº5. 31. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, en el que la IL-4 está codificada por el ácido nucleico heterólogo de la secuencia SEQ ID Nº7, o cualquier ácido nucleico que tenga por lo menos 70% de identidad con SED ID Nº7. 32. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31, en el que la IL-13 está codificada por el ácido nucleico heterólogo de la secuencia SEQ ID Nº8, o cualquier ácido nucleico que tenga por lo menos 70% de identidad con SED ID Nº8. 33. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32, en el que la población de células Tr1 específicas de antígenos así expandida se recupera en la etapa (d) después de haber cultivado la población de células Tr1 específicas de antígenos en la etapa (c) durante por lo menos 12 horas, ventajosamente 24 horas. 33   34     36   37   38   39     41   42   43   44