Una composición farmacéutica para administración parenteral, entérica u oral,

que comprende al menos un inhibidor de glutaminil ciclasa o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo

Campo de la invención

La invención se refiere a glutaminil ciclasa (QC, EC 2.3.2.5) que cataliza la ciclación intramolecular de restos de glutamina N-terminales a ácido piroglutámico (5ºxoprolina, pGlu*) con liberación de amoniaco y la ciclación intramolecular de restos de glutamato N-terminales a ácido piroglutámico con liberación de agua.

La presente invención identifica las QC de mamífero como metaloenzimas, proporciona sustratos fisiológicos novedosos de QC en mamíferos y el uso de inhibidores de QC y composiciones farmacéuticas que comprenden inhibidores de QC para el tratamiento de afecciones que pueden tratarse mediante la modulación de la actividad de QC. Adicionalmente, se muestra que la interacción metálica es un enfoque útil para el desarrollo de inhibidores de QC.

En una realización preferida, la presente invención proporciona el uso de inhibidores de la actividad de QC en combinación con inhibidores de DP IV o enzimas tipo DP IV para el tratamiento o el alivio de afecciones que pueden tratarse mediante la modulación de la actividad de QC y/o DP IV. Antecedentes

La glutaminil ciclasa (QC, EC 2.3.2.5) cataliza la ciclación intramolecular de restos de glutamina N-terminales a ácido piroglutámico (pGlu*) liberando amoniaco. Messer aisló por primera vez una QC a partir del látex de la planta tropical Carica papaya en 1963 (Messer,

M. 1963 Nature 4874, 1299). 24 años después, se descubrió una actividad enzimática correspondiente en pituitaria animal (Busby, W. H. J. y col. 1987 J. Biol. Chem. 262, 8532-8536; Fischer, W. H. y Spiess, J. 1987 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 3628-3632). Para la QC de mamífero, ha

podido demostrarse la conversión de Gln en pGlu por QC para los precursores de TRH y GnRH (Busby, W. H. J. y col. 1987

J. Biol. Chem. 262, 8532-8536; Fischer, W. H. y Spiess, J. 1987 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 3628-3632). Además, los experimentos de localización iniciales de QC revelaron una localización simultánea con sus presuntos productos de catálisis en pituitaria bovina, mejorando además la función sugerida en la síntesis de hormona peptídica (Bockers, T.

M. y col. 1995 J. Neuroendocrinol. 7, 445-453). En contraposición, la función fisiológica de la QC de planta es menos clara. En el caso de la enzima de C. papaya, se ha sugerido un papel en la defensa de la planta contra microorganismos patogénicos (El Moussaoui, A. y col. 2001 Cell. Mol. Life Sci. 58, 556-570). Se han identificado recientemente presuntas QC de otras plantas mediante comparaciones de secuencia (Dahl, S. W. y col. 2000 Protein Expr. Purif. 20, 27-36). Sin embargo, la función fisiológica de estas enzimas sigue siendo ambigua.

Las QC conocidas de plantas y animales muestran una especificidad estricta por L-glutamina en la posición N-terminal de los sustratos y se ha encontrado que su comportamiento cinético obedece la ecuación de Michaelis-Menten (Pohl, T. y col. 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10059-10063; Consalvo, A. P. y col. 1988 Anal. Biochem. 175, 131-138; Gololobov, M. Y. y col. 1996 Biol. Chem. Hoppe Seyler 377, 395-398). Sin embargo, una comparación de las estructuras primarias de las QC de C. papaya y las de la QC altamente conservada de mamíferos no reveló ninguna homología de secuencia (Dahl, S. W. y col. 2000 Protein Expr. Purif. 20, 27-36). Mientras que las QC de planta parecen pertenecer a una nueva familia de enzimas (Dahl, S.

W. y col. 2000 Protein Expr. Purif. 20, 27-36), se encontró que las QC de mamífero tenían una pronunciada homología de secuencia con aminopeptidasas bacterianas (Bateman, R. C. y col. 2001 Biochemistry 40, 11246-11250), conduciendo a la conclusión de que las QC de plantas y animales tienen diferentes orígenes evolutivos.

El documento EP 02011349.4 da a conocer polinucleótidos que codifican glutaminil ciclasa de insecto, así como los polipéptidos así codificados. Esta solicitud proporciona además células hospedadoras que comprenden vectores de expresión que comprenden polinucleótidos de la invención. Los polipéptidos aislados y células hospedadoras que comprenden QC de insecto son útiles en procedimientos de barrido de agentes que reduzcan la actividad glutaminil ciclasa. Dichos agentes se describen como útiles como plaguicidas.

La enfermedad de Alzheimer (EA) se caracteriza por una acumulación anormal de placas amiloidóticas extracelulares estrechamente asociadas a neuronas distróficas, astrocitos y microglia reactivos (Terry, R. D. y Katzman, R. 1983 Ann. Neurol. 14, 497-506; Glenner, G. G. y Wong, C. W. 1984 Biochem. Biophys. Res. Comm. 120, 885-890; Intagaki, S. y col. 1989 J. Neuroimmunol. 24, 173-182; Funato, H. y col. 1998 Am. J. Pathol. 152, 983-992; Selkoe, D. J. 2001 Physiol. Rev. 81, 741-766). Los péptidos β-amiloides (Aß) son los componentes principales de las placas seniles y se considera que están directamente implicados en la patogénesis y progresión de la EA, una hipótesis apoyada por estudios genéticos (Glenner, G. G. y Wong, C. W. 1984 Biochem. Biophys Res. Comm. 120, 885-890; Borchelt, D. R. y col. 1996 Neuron 17, 1005-1013; Lemere, C. A. y col. 1996 Nat. Med. 2, 1146-1150; Mann, D. M. e Iwatsubo, T. 1996 Neurodegeneration 5, 115-120; Citron, M. y col. 1997 Nat. Med. 3,67-72; Selkoe, D. J. 2001 Physiol. Rev. 81, 741766). El Aβ se genera mediante procesamiento proteolítico de la proteína precursora β-amiloide (APP) (Kang, J. y col. 1987 Nature 325, 733-736; Selkoe, D. J. 1998 Trends Cell. Biol. 8, 447-453), que se escinde secuencialmente por βsecretasa en el extremo N y por γ-secretasa en el extremo C de Aβ (Haass, C. y Selkoe, D. J. 1993 Cell 75, 1039-1042; Simons, M. y col. 1996 J. Neurosci. 16, 899-908). Además de los péptidos Aβ dominantes que empiezan por L-Asp en el extremo N (Aβ1-42/40), aparece una gran heterogeneidad de

formas truncadas N-terminales en placas seniles. Se ha notificado que dichos péptidos acortados son más neurotóxicos in vitro y que agregan más rápidamente que las isoformas completas (Pike, C. J. y col. 1995 J. Biol. Chem. 270 23895-23898). Los péptidos N-truncados son conocidos por sobreproducirse en sujetos con EA familiar de inicio temprano (EAF) (Saido, T. C. y col. 1995 Neuron 14, 457466; Russo, C. y col. 2000 Nature 405, 531-532), por aparecer temprano y aumentar con la edad en cerebros con síndrome de Down (SD) (Russo, C. y col. 1997 FEBS Lett. 409, 411-416, Russo, C. y col. 2001 Neurobiol. Dis. 8, 173180; Tekirian, T. L. y col. 1998 J. Neuropathol. Exp. Neurol. 57, 76-94). Finalmente, su cantidad refleja la gravedad progresiva de la enfermedad (Russo, C. y col. 1997 FEBS Lett. 409, 411-416). Los procesos postraduccionales adicionales pueden modificar además el extremo N mediante isomerización o racemización del aspartato en posición 1 y 7 y mediante ciclación del glutamato en los residuos 3 y

11. Las isoformas que contienen piroglutamato en posición 3 [pGlu3]Aβ3-40/42) representan las formas dominantes, aproximadamente un 50% de la cantidad total de Aβ, de la especie N-truncada en placas seniles (Mori, H. y col. 1992

J. Biol. Chem. 267, 17082-17086, Saido, T. C. y col. 1995 Neuron 14, 457-466; Russo, C. y col. 1997 FEBS Lett. 409, 411-416; Tekirian, T. L. y col. 1998 J. Neuropathol. Exp. Neurol. 57, 76-94; Geddes, J. W. y col. 1999 Neurobiol. Aging 20,75-79; Harigaya, Y. y col. 2000 Biochem. Biophys. Res. Commun. 276,422-427) y están también presentes en lesiones preamiloides (Lalowski, M. y col. 1996 J. Biol. Chem. 271, 33623-33631). La acumulación de péptidos AβN3(pE) es debida probablemente a la modificación estructural que potencia la agregación y confiere resistencia a la mayoría de aminopeptidasas (Saido, T. C. y col. 1995 Neuron 14, 457-466; Tekirian, T. L. y col. 1999

J. Neurochem. 73, 1584-1589). Esta evidencia proporciona pistas de un papel clave de los péptidos AßN3(pE) en la patogénesis de EA. Sin embargo, se sabe relativamente poco

sobre su neurotoxicidad y propiedades de agregación (He, W. y Barrow, C. J. 1999 Biochemistry 38, 10871-10877; Tekirian, T. L. y col. 1999 J. Neurochem. 73, 1584-1589). Además, la acción de estas isoformas sobre células gliales y la respuesta glial a estos péptidos son completamente desconocidas, aunque la glía activada está estrictamente asociada a placas seniles y podría contribuir activamente a la acumulación de depósitos amiloides. En estudios recientes, se investigaron la toxicidad, propiedades de agregación y catabolismo de los péptidos Aβ1-42, Aβ1-40, [pGlu3]Aβ3-42...

1. Una composición farmacéutica para administración parenteral, entérica u oral, que comprende al menos un inhibidor de glutaminil ciclasa o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

2. La composición farmacéutica según la reivindicación 1, que comprende adicionalmente un inhibidor de DP IV o una enzima tipo DP IV, en la que la enzima tipo DP IV se selecciona de proteína α activadora de fibroblastos, dipeptidil peptidasa IV β, proteína tipo dipeptidil aminopeptidasa, dipeptidasa ácida N-acetilada-α-ligada, dipeptidasa de prolina de células quiescentes, dipeptidil peptidasa II, atractina y DPP 8, DP 6, DPL 2, DPP 9 y DPP

10.

3. Uso de una composición farmacéutica según las reivindicaciones 1 ó 2 para la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de una enfermedad seleccionada de enfermedad de Alzheimer y síndrome de Down.

4. Una composición farmacéutica según las reivindicaciones 1 ó 2 para el tratamiento de una enfermedad seleccionada de enfermedad de Alzheimer y síndrome de Down.

5. Uso de un inhibidor de glutaminil ciclasa, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de una enfermedad seleccionada de enfermedad de Alzheimer y síndrome de Down.

6. Un inhibidor de glutaminil ciclasa, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la prevención o el tratamiento de una enfermedad seleccionada de enfermedad

de Alzheimer y síndrome de Down.

7. El uso o el inhibidor de glutaminil ciclasa según las reivindicaciones 5 ó 6, en los que el inhibidor de 5 glutaminil ciclasa se usa en combinación con un inhibidor de DP IV o una enzima tipo DP IV, en los que la enzima tipo DP IV se selecciona de proteína α activadora de fibroblastos, dipeptidil peptidasa IV β, proteína tipo dipeptidil aminopeptidasa, dipeptidasa ácida N-acetilada-αligada, dipeptidasa de prolina de células quiescentes, dipeptidil peptidasa II, atractina y DPP 8, DP 6, DPL 2, DPP 9 y DPP 10.

8. La composición farmacéutica o el inhibidor de glutaminil ciclasa o el uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en los que el inhibidor de glutaminil ciclasa es un inhibidor competitivo.

9. La composición farmacéutica o el inhibidor de glutaminil ciclasa o el uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en los que el inhibidor de glutaminil ciclasa se selecciona de 3-(1H-Imidazol-1-il)-1-(3metilbenzo[b]tiofen-2-il)propan-1-ona

4-[(1-Metil-1H-imidazol-5-il)metil]-3propildihidrofuran-2-(3H)-ona

Ácido 4-[(2-1H-imidazol-1-il)etoxi]benzoico

**(Ver fórmula)**

3-[3-(1H-imidazol-1-il)propil]-2tioxoimidazolidin-4-ona

5-Nitro-2-[2-([{3-(1H-imidazol-1il)propil}amino]carbonil)fenil]furamida

**(Ver fórmula)**

1-Bencilimidazol

10. El inhibidor de glutaminil ciclasa o el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 3 y 5 a 9, caracterizados por que se inhibe la conversión de residuos de ácido glutámico o glutamina N-terminales en residuos de ácido piroglutámico de al menos un sustrato de glutaminil ciclasa seleccionado de Aβ3-40/42, [Gln3]Aβ3-40/42, [Glu11]Aβ11-40/42 y [Gln11]Aβ11-40/42.

11. El inhibidor de glutaminil ciclasa o el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 3 y 7 a 10, en los que se bloquea la actividad que genera H-isoAsp-Ala-OH de la enzima tipo DP IV.

12. El inhibidor de glutaminil ciclasa o el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 3 y 7 a 11, en los que la enzima tipo DP IV es DP II.

13. El inhibidor de glutaminil ciclasa o el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 3 y 7 a 10, en los que el inhibidor de DP IV se selecciona del grupo constituido por L-treo-isoleuciltiazolidina, L-aloisoleuciltiazolidina, L-treo-isoleucilpirrolidina, L-aloisoleucilpirrolidina, NVP-DPP728A (1-[[[2-[{5-cianopiridin2-il}amino]etil]amino]acetil]-2-ciano-(S)-pirrolidina), LAF-237 (1-[(3-hidroxiadamant-1-ilamino)acetil]pirrolidin2(S)-carbonitrilo), TSL-225 (ácido triptofil-1,2,3,4

tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico), FE-999011, Nvalilprolilo, O-benzoilhidroxilamina, alanilpirrolidina, HAsn-pirrolidina, H-Asn-tiazolidina, H-Asp-pirrolidina, HAsp-tiazolidina, H-Asp(NHOH)-pirrolidina, H-Asp(NHOH)tiazolidina, H-Glu-pirrolidina, H-Glu-tiazolidina, HGlu(NHOH)-pirrolidina, H-Glu(NHOH)-tiazolidina, H-Hispirrolidina, H-His-tiazolidina, H-Pro-pirrolidina, H-Protiazolidina, H-Ile-azididina, H-lle-pirrolidina, H-L-alolle-tiazolidina, H-Val-pirrolidina y H-Val-tiazolidina, ácido 2-aminoctanoico-Pro-Ile, Abu-Pro-Ile, Aib-Pro-lle, Aze-Pro-Ile, Cha-Pro-Ile, Ile-Hyp-Ile, Ile-Pro-alo-Ile, Ile-Pro-terc-butil-Gly, Ile-Pro-Val, Nle-Pro-Ile, Nva-Pro-Ile, Orn-Pro-Ile, Phe-Pro-Ile, Phg-Pro-lle, Pip-Pro-Ile, Ser(Bzl)-Pro-lle, Ser(P)-Pro-Ile, Ser-Pro-Ile, terc-butil-Gly-Pro-D-Val, terc-butil-Gly-Pro-Gly, terc-butil-Gly-Pro-Ile, terc-butil-Gly-Pro-Ile-amida, terc-butil-Gly-Pro-tercbutil-Gly, terc-butil-Gly-Pro-Val, Thr-Pro-Ile, Tic-Pro-Ile, Trp-Pro-Ile, Tyr(P)-Pro-Ile, Tyr-Pro-alo-lle, Val-Proalo-lle, Val-Pro-terc-butil-Gly, Val-Pro-Val o una sal farmacéuticamente aceptable los mismos.

14. El inhibidor de glutaminil ciclasa o el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 3 y 7 a 10, en los que el inhibidor de DP IV se selecciona del grupo constituido por

bromhidrato de 2-metilcarbonil-1-N-[(L)-alanil-(L)valinil]-(2S)-pirrolidina, bromhidrato de 2-metilcarbonil-1-N-[(L)-valinil-(L)prolil-(L)-valinil]-(2S)-pirrolidina, bromhidrato de 2-[(acetiloximetil)carbonil]-1-N-[(L)alanil-(L)-valinil]-(2S)-pirrolidina, bromhidrato de 2-[(benzoiloximetil)carbonil]-1-N[{(L)-alanil}-(L)-valinil]-(2S)-pirrolidina, 2-{[(2,6-diclorobencil)tiometil]carbonil}-1-N-[{(L)alanil}-(L)-valinil]-(2S)-pirrolidina, bromhidrato de 2-[(benzoiloximetil)carbonil]-1-N[glicil-(L)-valinil]-(2S)-pirrolidina,

trifluoroacetato de 2-[([1,3]-tiazoltiazol-2il)carbonil]-1-N-[{(L)-alanil}-(L)-valinil]-(2S)pirrolidina,

trifluoroacetato de 2-[(benzotiazoltiazol-2il)carbonil]-1-N-[N-{(L)-alanil}-(L)-valinil]-(2S)pirrolidina,

trifluorocetato de 2-[(benzotiazoltiazol-2il)carbonil]-1-N-[{(L)-alanil}glicil]-(2S)-pirrolidina,

trifluoroacetato de 2-[(piridin-2-il)carbonil]-1-N-[N{(L)-alanil}-(L)-valinil]-(2S)-pirrolidina

cloruro de 1-ciclopentil-3-metil-1-oxo-2-pentanaminio,

cloruro de 1-ciclopentil-3-metil-1-oxo-2-butanaminio,

cloruro de 1-ciclopentil-3,3-dimetil-1-oxo-2butanaminio,

cloruro de 1-ciclohexil-3,3-dimetil-1-oxo-2butanaminio,

cloruro de 3-(ciclopentilcarbonil)-1,2,3,4tetrahidroisoquinolinio,

cloruro de N-(2-ciclopentil-2-oxoetil)ciclohexanaminio

u otras sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

15. La composición farmacéutica o el inhibidor de glutaminil ciclasa o el uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en los que el inhibidor de glutaminil ciclasa se une al ión metálico unido al sitio activo de glutaminil ciclasa.