Un procedimiento para identificar un ligando para una molécula diana,

comprendiendo el procedimiento:

proporcionar un compuesto de referencia marcado con 19F que interacciona con la molécula diana;

recoger un espectro de resonancia magnética nuclear de 19F 1D del compuesto de referencia marcado con 19F en presencia de la molécula diana;

proporcionar una muestra de ensayo que comprende al menos un compuesto de ensayo;

recoger un espectro de resonancia magnética nuclear de 19F 1D del compuesto de referencia marcado con 19F en presencia de cada uno de la muestra de ensayo y la molécula diana;

comparar el espectro del compuesto de referencia marcado con 19F en presencia de la molécula diana con el espectro del compuesto de referencia marcado con 19F en presencia de cada uno de la muestra de ensayo y la molécula diana para determinar un cambio en uno o más de las resonancias del compuesto de referencia marcado con 19F; e

identificar al menos un compuesto de ensayo que interaccione con la molécula diana, en el que el compuesto de ensayo desplaza el compuesto de referencia marcado con 19F

Uso de RMN de flúor para el rastreo de alto rendimiento.

Antecedentes de la invención

Muchos fármacos actualmente en el mercado se desarrollaron a partir de artículos principales identificados a partir del rastreo de alto rendimiento (HTS). Las dianas de interés terapéutico usadas en HTS a menudo son proteínas recombinante producidas a partir de genes clonados que pueden expresarse de diferentes modos. Típicamente se rastrea una gran colección de compuestos frente a estas proteínas para la identificación de inhibidores.

Durante los últimos diez años, ha aumentado exponencialmente el tamaño de la colección de compuestos de propietarios como resultado de la aplicación sistemática de química combinatoria a diferentes proyectos. La química combinatoria hoy en día genera grandes bibliotecas de compuestos que complementan otras bibliotecas de compuestos disponibles en la química de medicina tradicional y fuentes naturales. El desarrollo y aplicación de la robótica y la automación han hecho factible ensayar grandes cantidades de compuestos en un corto periodo de tiempo. Se usan varios sistemas de detección nuevos para la identificación de moléculas principales potenciales.

Recientemente, ha surgido la resonancia magnética nuclear (RMN) como un procedimiento potente para la detección de pequeñas moléculas que interaccionan con dianas de interés farmacéutico. Aunque la RMN no es una técnica sensible, tiene la ventaja de que está menos sometida a los artefactos observados con otros sistemas de detección. Los recientes avances en la tecnología criogénica de sondas de RMN han reducido el periodo de tiempo o la cantidad de proteína necesaria para el rastreo. Los procedimientos de RMN se han usado para rastrear una gran colección de compuestos frente a proteínas isotópicamente marcadas. Los cambios en el desplazamiento químicos de los picos de cruce en un espectro de HSQC de ¹⁵N-¹H de la proteína diana se controlan en presencia de una mezcla de compuestos. La deconvolución de la mezcla entonces provoca la identificación de la molécula que interacciona con la proteína (es decir, el compuesto responsable de los cambios de desplazamiento químico). Cuando se conoce la estructura tridimensional de la proteína y se han obtenido las asignaciones de RMN específicas de secuencia de las resonancias de la estructura proteica, el procedimiento proporciona información estructural importante del sitio de unión de ligando y el modo de unión del ligando.

Otro procedimiento para realizar rastreo de RMN se basa en la detección de las resonancias del ligando. Se han propuesto varios parámetros de RMN en la bibliografía como herramienta para la identificación de ligandos. Estas metodologías permiten la rápida deconvolución de las mezclas rastreadas y son particularmente adecuadas para la identificación de ligados de afinidad media a baja.

Sin embargo, estas técnicas tienen algunos inconvenientes. Primero, no hay información estructural directamente disponible con respecto al sitio de unión. Segundo, los ligandos y moléculas de elevada afinidad que se unen covalentemente al receptor escapen de la detección a causa del gran exceso de compuesto de ensayo sobre la proteína típicamente usada en estos experimentos. Es decir, no se detectarán compuestos que interaccionan de forma estrecha con la proteína o compuestos que tienen una cinética lenta porque el tiempo de residencia de estos compuestos dentro de la proteína es mayor que la ventana del tiempo de mezcla (por ejemplo, 1 a 2 segundos) empleada en los experimentos de RMN. Tercero, los compuestos con malas solubilidades que son ligandos potenciales son difíciles de detectar ya que el procedimiento requiere la observación de las señales del ligando.

Por tanto, los que se necesita son procedimientos de RMN adicionales que puedan usarse para detectar ligandos para moléculas diana, tales como proteínas, sin los inconvenientes asociados con experimentos típicos de rastreo de observación de ligando.

El artículos Dalvit C. y col., "NMR-Based Screening with Competition Water-Ligand Observed via Gradient Spectroscopy Experiments: Detection of High-Affinity Ligands", J. Med. Chem. 2002, 45, 2610-2614 describe un procedimiento para identificar un ligando para una molécula diana, comprendiendo el procedimiento: proporcionar un compuesto de referencia que interacciones con la molécula diana; recoger un espectro de resonancia magnética nuclear 1D del compuesto de referencia en presencia de la molécula diana; proporcionar una muestra de ensayo que comprende al menos un compuesto de ensayo; recoger un espectro de resonancia magnética nuclear 1D del compuesto de referencia en presencia de cada uno de la muestra de ensayo y la molécula diana; comparar el espectro del compuesto de referencia en presencia de la molécula diana con el espectro del compuesto de referencia en presencia de cada uno de la muestra de ensayo y la molécula diana para determinar un cambio en una o más de las resonancias del compuesto de referencia; e identificar al menos un compuesto de ensayo que interaccione con la molécula diana, donde el compuesto de ensayo desplaza al compuesto de referencia.

El artículo Jenkins B.G., "Detection of Site-Specific Binding and Co-Binding of Ligands to Macromolecules using 19F NMR", Life Sciences 1991, 48, 1227-1240 describe ventajas de usar espectroscopía de RMN de 19F para observar interacciones de macromoléculas-ligandos.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere al diseño racional de fármacos. Específicamente, la presente invención proporciona un procedimiento de resonancia magnética nuclear (RMN) para rastrear compuestos que interaccionen con una molécula diana (por ejemplo, típicamente una proteína). El procedimiento implica el uso de RMN de ¹⁹F, particularmente experimentos de unión competitiva de RMN de ¹⁹F, para detectar la interacción de unión.

Los experimentos de unión competitiva implican el desplazamiento de un compuesto de referencia en presencia de una molécula competitiva. Preferiblemente, el compuesto de referencia se une a la molécula diana con una afinidad de unión en el intervalo micromolar. Preferiblemente, el compuesto de ensayo interacciona con la molécula diana con una afinidad de unión más fuerte que 1 micromolar (por ejemplo, en el intervalo nanomolar), aunque también puede evaluarse la unión de compuestos con afinidades de unión más débiles de (es decir, de más de) 1 micromolar usando los procedimientos de la presente invención.

La presente metodología, particularmente cuando implica experimentos de unión competitiva, puede usarse para realizar un rastreo de alto rendimiento (HTS) eficaz basada en experimentos de unión competitiva establecidos apropiadamente sin los inconvenientes asociados con experimentos típicos de rastreo de observación de ligando. Además, los procedimientos proporcionan una estimación de la K_D del ligando identificado usando una medición de un único punto. Con este enfoque, es posible rastrear miles de compuestos en un corto periodo de tiempo frente a una proteína o fragmentos de ADN y ARN, por ejemplo.

La presente invención también podría encontrar aplicaciones útiles para el rastreo rápido de mezclas químicas (es decir, mezclas de dos o más compuestos de ensayo) tales como extractos vegetales y fúngicos. Las técnicas de rastreo rápido típicamente implican proporcionar una pluralidad de muestras de ensayo, comprendiendo cada muestra de ensayo una mezcla de dos o más compuestos de ensayo.

Los procedimientos de la presente invención implican identificar un ligando para una molécula diana usando las etapas expuestas en la reivindicación 1.

Preferiblemente, los procedimientos de la presente invención incluyen una etapa de identificar el compuesto de referencia que comprende: recoger un espectro de resonancia magnética nuclear WaterLOGSY de un compuesto de referencia potencial en ausencia de la molécula diana; recoger un espectro de resonancia magnética nuclear WaterLOGSY del compuesto de referencia potencial en presencia de la molécula diana; y comparar los espectros WaterLOGSY para identificar si el compuesto de referencia potencial interacciona con la molécula diana.

Para ciertas realizaciones de los procedimientos de la presente invención, el compuesto de referencia se proporciona en combinación con una señal ERETIC con anchura de línea, amplitud, y frecuencia definidos. Para estos procedimientos, la recogida de un espectro de resonancia magnética nuclear de ¹⁹F 1D...

1. Un procedimiento para identificar un ligando para una molécula diana, comprendiendo el procedimiento:

proporcionar un compuesto de referencia marcado con ¹⁹F que interacciona con la molécula diana;

recoger un espectro de resonancia magnética nuclear de ¹⁹F 1D del compuesto de referencia marcado con ¹⁹F en presencia de la molécula diana;

proporcionar una muestra de ensayo que comprende al menos un compuesto de ensayo;

recoger un espectro de resonancia magnética nuclear de ¹⁹F 1D del compuesto de referencia marcado con ¹⁹F en presencia de cada uno de la muestra de ensayo y la molécula diana;

comparar el espectro del compuesto de referencia marcado con ¹⁹F en presencia de la molécula diana con el espectro del compuesto de referencia marcado con ¹⁹F en presencia de cada uno de la muestra de ensayo y la molécula diana para determinar un cambio en uno o más de las resonancias del compuesto de referencia marcado con ¹⁹F; e

identificar al menos un compuesto de ensayo que interaccione con la molécula diana, en el que el compuesto de ensayo desplaza el compuesto de referencia marcado con ¹⁹F.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el compuesto de ensayo tiene una afinidad de unión al menos tan fuerte como la del compuesto de referencia.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que un cambio en una o más de las resonancias del compuesto de referencia comprende un aumento en la intensidad de señal en al menos una resonancia de referencia.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la identificación de al menos un compuesto de ensayo comprende registrar diferentes espectros de resonancia magnética nuclear de ¹⁹F 1D del compuesto de referencia marcado con ¹⁹F en presencia de cada uno del compuesto de ensayo y la molécula diana.

5. El procedimiento de la reivindicación 1 que comprende adicionalmente:

recoger espectros de resonancia magnética nuclear de ¹⁹F 1D del compuesto de referencia en presencia de la molécula diana a diferentes concentraciones del compuesto de referencia marcado con ¹⁹F; y

determinar la constante de disociación del compuesto de ensayo.

6. El procedimiento de la reivindicación 1 que comprende adicionalmente:

recoger espectros de resonancia magnética nuclear de ¹⁹F 1D del compuesto de referencia marcado con ¹⁹F en presencia de la molécula diana a diferentes concentraciones de la molécula diana; y

determinar la constante de disociación del compuesto de ensayo.

7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que antes de la recogida de un espectro de resonancia magnética nuclear de ¹⁹F 1D del compuesto de referencia marcado con ¹⁹F en presencia de la molécula diana para su uso en la etapa de comparación, el procedimiento comprende:

recoger espectros de resonancia magnética nuclear de ¹⁹F 1D del compuesto de referencia marcado con ¹⁹F en presencia de la molécula diana a diferentes concentraciones de la molécula diana o a diferentes concentraciones del compuesto de referencia marcado con ¹⁹F; y

determinar las condiciones experimentales óptimas para identificar al menos un compuesto de ensayo que interaccione con la molécula diana.

8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la molécula diana es una macromolécula.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que la macromolécula es un polipéptido o polinucleótido.

10. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que la macromolécula es una proteína.

11. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el compuesto de referencia se une a la molécula diana con una afinidad de unión en el intervalo micromolar.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la afinidad de unión del compuesto de referencia se determina por calorimetría de valoración isotérmica o espectroscopía de fluorescencia.

13. El procedimiento de la reivindicación 1 que comprende adicionalmente una etapa para identificar el compuesto de referencia que comprende:

recoger un espectro de resonancia magnética nuclear WaterLOGSY de un compuesto de referencia potencial en ausencia de la molécula diana;

recoger un espectro de resonancia magnética nuclear WaterLOGSY del compuesto de referencia potencial en presencia de la molécula diana; y

comparar los espectros WaterLOGSY para identificar si el compuesto de referencia potencial interacciona con la molécula diana.

14. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la muestra de ensayo comprende una mezcla de dos o más compuestos de ensayo.

15. El procedimiento de la reivindicación 14 que comprende adicionalmente:

recoger un espectro de resonancia magnética nuclear de ¹⁹F 1D del compuesto de referencia marcado con ¹⁹F en presencia de cada uno del compuesto de ensayo y la molécula diana; y

comparar el espectro del compuesto de referencia en presencia de la molécula diana con el espectro del compuesto de referencia en presencia de cada uno del compuesto de ensayo y la molécula diana para determinar un cambio en la resonancia del compuesto de referencia marcado con ¹⁹F seleccionado.

16. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el compuesto de ensayo tiene una afinidad de unión más fuerte que la del compuesto de referencia.

17. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que:

proporcionar un compuesto de referencia marcado con ¹⁹F comprende proporcionar un compuesto de referencia marcado con ¹⁹F y una señal ERETIC con anchura de línea, amplitud, y frecuencia definidas;

recoger un espectro de resonancia magnética nuclear de ¹⁹F 1D del compuesto de referencia marcado con ¹⁹F en presencia de la molécula diana comprende recoger un espectro del compuesto de referencia marcado con ¹⁹F con la señal ERETIC en presencia de la molécula diana; y

recoger un espectro de resonancia magnética nuclear de ¹⁹F 1D del compuesto de referencia marcado con ¹⁹F en presencia de cada uno de la muestra de ensayo y la molécula diana comprende recoger un espectro del compuesto de referencia marcado con ¹⁹F con la señal ERETIC en presencia de cada uno de la muestra de ensayo y la molécula diana.

18. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que:

proporcionar un compuesto de referencia marcado con ¹⁹F comprende proporcionar un compuesto de referencia marcado con ¹⁹F y un compuesto no de interacción marcado con ¹⁹F;

recoger un espectro de resonancia magnética nuclear de ¹⁹F 1D del compuesto de referencia marcado con ¹⁹F en presencia de la molécula diana comprende recoger un espectro del compuesto de referencia marcado con ¹⁵F y el compuesto no de interacción marcado con ¹⁹F en presencia de la molécula diana; y

recoger un espectro de resonancia magnética nuclear de ¹⁹F 1D del compuesto de referencia marcado con ¹⁹F en presencia de cada uno de la muestra de ensayo y la molécula diana comprende recoger un espectro del compuesto de referencia marcado con ¹⁹F y el compuesto no de interacción marcado con ¹⁹F en presencia de cada uno de la muestra de ensayo y la molécula diana.

19. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que proporcionar una muestra de ensayo comprende proporcionar una pluralidad de muestras de ensayo, comprendiendo cada muestra de ensayo al menos un compuesto de ensayo.