Procedimiento para aumentar la expresión de transgén.

Procedimiento para aumentar la expresión de transgenes en una planta transgénica,

comprendiendo dicho procedimiento

a) integrar el primer intrón de la 5’ UTR de un gen GOS2 de planta en el extremo 5’ de un ácido nucleico de interés, creando de este modo una unidad transcripcional quimérica, en la que dicho primer intrón se representa en la SEC ID Nº: 5 o una variante funcional de dicho primer intrón, cuya variante funcional es de al menos 65 pares de bases de longitud, comprende sitios de corte y empalme y una adenosina de punto de ramificación funcional, siendo dicha adenosina de punto de ramificación parte del motivo conservado con la siguiente secuencia consenso Y100U100R64A100U50 o Y100U100R64A100Y70, en la que Y representa los nucleótidos C o T, y R representa A y G, y en la que los números en subíndice indican el porcentaje de conservación del nucleótido respectivo, cuya variante funcional es capaz de hibridar en condiciones rigurosas con el primer intrón como se representa en SEC ID Nº: 5, en la que dichas condiciones de hibridación son hibridación en SCC 4 x a 65 ºC, seguido de una etapa de lavado en SCC 0, 1 x a 65 ºC durante una hora;

b) fusionar operativamente dicha unidad transcripcional quimérica con un promotor expresable en plantas para obtener un casete de expresión, a condición de no haya combinación de la 5’ UTR como se representa en SEC ID Nº: 2 del gen GOS2 del arroz con un promotor del gen GOS2 del arroz;

c) introducir y expresar en una célula vegetal dicho casete de expresión de (b), para crear una célula vegetal transgénica; y

d) regenerar y/o cultivar una planta a partir de dicha célula vegetal transgénica de (c) de modo que dicha célula transgénica transcriba el transgén y en la que la 5’UTR del ácido nucleico expresado de interés comprende al menos el primer intrón de la 5’UTR como se define en (a) .

Procedimiento para aumentar la expresión de transgén La presente invención se refiere a procedimientos para aumentar la expresión de transgén en plantas. En particular, la presente invención se refiere al uso de la región no traducida 5’ (5’UTR) de un gen GOS2, particularmente al uso del primer intrón de un gen GOS2 para potenciar la transcripción. La presente invención también se refiere a procedimientos para modificar la composición de semillas y en particular para aumentar la transcripción o expresión de proteínas en plantas.

Los niveles de proteínas en una célula se determinan por un lado por su velocidad de degradación y por otro lado por su velocidad de síntesis. La velocidad de síntesis proteica depende de diversos procesos, tales como transcripción, procesamiento de ARN postranscripcional, traducción y modificaciones postraduccionales. La primera etapa en la síntesis proteica es la transcripción, el proceso de copiar ADN a una molécula de ARN. Además del promotor, que es la parte más importante de un gen que controla el nivel y patrón de transcripción, también se conoce bien que la región no traducida 5’ (5’UTR) de un transcrito de ARN primario tiene influencia en el nivel y patrón de expresión de genes vegetales. Se sabe que los genes vegetales contienen un intrón en su 5’UTR; los estudios de regulación y expresión génica han demostrado que estos intrones pueden tener un impacto positivo en a transcripción. Los ejemplos incluyen intrones de Arabidopsis (Rose y Last, Plant J. 11, 455-464, 1997; Chaubet-Gigot y col., Plant Mol. Biol. 45, 17-30, 2001) , semilla de ricino (Ricinus communis; Tanaka y col., Nucleic Acids Res. 18, 6767-6770, 1990) , avena (Avena sativa; Bruce y Quail, Plant Cell 2, 1081-1089, 1990) , petunia (Petunia hybrida; Dean y col., Plant Cell 1, 201-208, 1989; Vain y col., Plant Cell Rep. 15, 489-494, 1996) , arroz (Or y za sativa; McElroy y col., Plant Cell 2, 163-171, 1990; Snowden y col., Plant Mol. Biol. 31, 689-692, 1996; Rethmeier y col., Plant J. 12, 895-899, 1997) , soja (Glycine max; Kato y col., Biosci. Biotechnol. Biochem. 62, 151-153, 1998) , patata (Solanum tuberosum; Leon y col., Plant Physiol. 95, 968-972, 1991; Fu y col., Plant Cell 7, 1387-1394, 1995; Fu y col., Plant Cell 7, 1395-1403, 1995) y tabaco (Nicotiana tabacum; Plesse y col., Plant Mol. Biol. 45, 655-667, 2001) .

El mecanismo que subyace en esta potenciación mediada por intrón de la transcripción aún no está claro, pero los intrones deben estar en su orientación normal con respecto a la región transcrita del gen (Callis y col., Genes Dev. 1, 1183-1200, 1987; Clancy y col., Plant Sci. 98, 151-161, 1994; Mascarenhas y col., Plant Mol. Biol. 15, 913-920, 1990) . Un estudio del intrón 1 de PAT1 en Arabidopsis (Rose, RNA 8, 1444-1453, 2002) demostró que se requería la maquinaria de corte y empalme, pero que el corte y empalme del intrón no era suficiente para potenciar la acumulación de ARNm. De acuerdo con al modelo presentado, los intrones podrían estimular la acumulación de ARNm aumentando la capacidad de procesamiento de la ARN polimerasa II mediante una modificación de su domino carboxilo terminal, promoviendo de este modo la elongación del transcrito sin afectar significativamente al inicio de la transcripción. Sería por lo tanto más probable que la transcripción de genes que contenían un intrón extendiera la longitud del gen en casos en los que el procesamiento del extremo 3’ produjera transcritos estables. Los estudios sugieren que la presencia de un intrón aumenta la probabilidad de que se realicen transcritos estables de longitud completa, conduciendo de este modo a acumulación de ARNm aumentada (Rose, 2002) . Clancy y Hannah (Plant Physiol. 130, 918-929, 2002) usaron fusiones de genes indicadores para identificar elementos del primer intrón de Sh1 requerido para la potenciación en células de maíz cultivado. Descubrieron que un derivado de 145 pb del intrón Sh1 confería aproximadamente la misma estimulación de 20 a 50 veces típica para el intrón de longitud completa en su sistema de expresión transitoria. Además, se descubrió que se requería un motivo de 35 pb contenido dentro del intrón para niveles máximos de potenciación pero no para corte y empalme de transcrito eficaz. El elemento importante de este motivo de pb redundante es la riqueza en T en lugar de la secuencia específica. Cuando se anuló el corte y empalme del transcrito por mutaciones en los límites de los intrones, la potenciación se redujo a aproximadamente 2 veces. Se descubrió que el requisito de corte y empalme para potenciación no se debía a codones de inicio de la traducción cadena arriba contenidos en transcritos no cortados. Los autores concluyeron que el corte y empalme del intrón Sh1 era integral para la potenciación y sugirieron que las modificaciones de transcrito desencadenadas por el motivo rico en T y corte y empalme pueden ligar el ARNm con el sistema de tráfico de la célula. Otros informes sugieren que la longitud y composición de las secuencias flanqueantes pueden contribuir a la expresión génica potenciada mediada por intrones (Sinibaldi y Mettler, In WE Cohn, K Moldave, eds, Progress en Nucleic Acid Research and Molecular Biology, Vol. 42. Academic Press, Nueva York, pp 229-257, 1992; Luehrsen y Walbot, Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 47, 149-193, 1991; Maas y col., Plant Mol. Biol. 16, 199-207, 1991; Clancy y col., 1994) , o que la magnitud de la estimulación también depende de las secuencias codificantes (Sinibaldi y Mettler, 1992; Rethmeier y col., 1997; Rethmeier y col., Plant J. 13, 831-835, 1998) , el tejido de expresión y las condiciones fisiológicas (Tanaka y col., 1990; Sinibaldi y Mettler, 1992; Gallie y Young, Plant Physiol. 106, 929-939, 1994; Fu y Park, 1995a, 1995b; Chaubet-Gigot y col., 2001; Plesse y col., 2001) .

GOS2 del arroz es un gen de copia única que codifica el factor de inicio de la traducción en IF1, que está implicado en el ensamblaje del complejo 43S con ARNm y en la exploración correcta de la 5’UTR hacia el ATG durante el inicio de la traducción. El gen GOS2 también se encuentra en otros organismos tales como levadura y mamíferos, y para cada uno de estos, el primer intrón se localiza en la 5’UTR. En su ambiente natural, la proteína GOS2 del arroz se expresa bajo el control de su promotor fuerte y constitutivo. Este promotor se usa ampliamente como una alternativa al promotor CaMV35S en la ingeniería genética de plantas monocotiledóneas. Hensgens y col. (Plant Mol. Biol. 23, 643-669, 1993) estudiaron la expresión del gen indicador gusA conducido por el promotor GOS2. Describen un primer tipo de construcción que comprende, de 5’ a 3’, un promotor transcripcional de GOS2, el sitio de inicio de la traducción, los dos primeros exones e intrones y parte del tercer exón, una región de poliligador, la secuencia codificante de gusA y una región de poliadenilación. Hensgens y col. también describen un segundo tipo de construcción, en la que gusA estaba fusionado con los primeros 36 nucleótidos del primer exón de GOS2 y por lo tanto carecía de los primeros dos intrones. Se observó la mayor expresión de GUS para el primer tipo de construcción, sin embargo los autores no pudieron determinar si la diferencia en el nivel de expresión entre los dos tipos de construcciones era atribuible a la presencia de los dos intrones. Hasta la fecha, no se ha realizado ningún análisis del papel de los intrones en el gen GOS2 en el proceso de transcripción.

Se determinan propiedades fenotípicas de plantas por la expresión de uno o más genes en el genoma vegetal. El nivel y patrón de expresión apropiados (patrones de expresiones temporales y espaciales) de los genes pueden depender de muchos elementos reguladores, incluyendo el tipo de promotor y las regiones no traducidas del ARNm. Estos elementos reguladores pueden usarse ventajosamente para adaptar la expresión de los genes a necesidades particulares. Por ejemplo, un promotor puede tener la expresión espacial deseada (tal como expresión específica de raíz o específica de flor) , pero puede carecer de la fuerza para asegurar niveles de expresión altos. En dichos casos, un experto en la materia puede considerar usar elementos reguladores adicionales para potenciar los niveles de expresión. Se conocen en la técnica ejemplos de elementos reguladores para modular los niveles o patrones de expresión e incluyen secuencias activadoras corriente arriba, elementos próximos al promotor, potenciadores y silenciadores. Se han descrito varios genes para los que la presencia de intrones contribuyó significativamente al nivel de expresión. Sin embargo, el mecanismo de este aumento apenas se entiende.

Para obtener los niveles o patrones de expresión... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para aumentar la expresión de transgenes en una planta transgénica, comprendiendo dicho procedimiento

a) integrar el primer intrón de la 5’ UTR de un gen GOS2 de planta en el extremo 5’ de un ácido nucleico de interés, creando de este modo una unidad transcripcional quimérica, en la que dicho primer intrón se representa en la SEC ID Nº: 5 o una variante funcional de dicho primer intrón, cuya variante funcional es de al menos 65 pares de bases de longitud, comprende sitios de corte y empalme y una adenosina de punto de ramificación funcional, siendo dicha adenosina de punto de ramificación parte del motivo conservado con la siguiente secuencia consenso Y100U100R64A100U50 o Y100U100R64A100Y70, en la que Y representa los nucleótidos C o T, y R representa A y G, y en la que los números en subíndice indican el porcentaje de conservación del nucleótido respectivo, cuya variante funcional es capaz de hibridar en condiciones rigurosas con el primer intrón como se representa en SEC ID Nº: 5, en la que dichas condiciones de hibridación son hibridación en SCC 4 x a 65 ºC, seguido de una etapa de lavado en SCC 0, 1 x a 65 ºC durante una hora; b) fusionar operativamente dicha unidad transcripcional quimérica con un promotor expresable en plantas para obtener un casete de expresión, a condición de no haya combinación de la 5’ UTR como se representa en SEC ID Nº: 2 del gen GOS2 del arroz con un promotor del gen GOS2 del arroz; c) introducir y expresar en una célula vegetal dicho casete de expresión de (b) , para crear una célula vegetal transgénica; y d) regenerar y/o cultivar una planta a partir de dicha célula vegetal transgénica de (c) de modo que dicha célula transgénica transcriba el transgén y en la que la 5’UTR del ácido nucleico expresado de interés comprende al menos el primer intrón de la 5’UTR como se define en (a) .

2. Procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho transgén codifica un polipéptido.

3. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2, en el que dicha planta transgénica es una planta monocotiledónea.

4. Procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicha planta monocotiledónea es un cereal, tal como arroz o maíz.

5. Procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho gen GOS2 de planta se origina de una planta monocotiledónea, preferentemente de arroz o maíz.

6. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho promotor expresable en plantas se selecciona del grupo que consiste en:

(i) un promotor constitutivo;

(ii) un promotor inducible;

(iii) un promotor con preferencia de tejido;

(iv) un promotor con preferencia de órgano;

(v) un promotor regulado por el desarrollo.

7. Procedimiento de la reivindicación 6, en el que dicho promotor con preferencia de órgano es un promotor con preferencia de semilla.

8. Procedimiento de la reivindicación 6, en el que dicho promotor con preferencia de tejido es un promotor con preferencia de endospermo.

9. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicha unidad transcripcional quimérica comprende un ácido nucleico de interés fusionado en su extremo 5’ con el extremo 3’ del primer intrón de la 5’UTR de un gen GOS2 de planta.

10. Uso del primer intrón como se representa en la SEC ID Nº: 5 o una variante funcional de dicho primer intrón, cuya variante funcional es de al menos 65 pares de bases de longitud, comprende sitios de corte y empalme y una adenosina de punto de ramificación funcional, siendo dicha adenosina de punto de ramificación parte del motivo conservado con la siguiente secuencia consenso Y100U100R64A100U50 o Y100U100R64A100Y70, en la que Y representa los nucleótidos C o T, y R representa A y G, y en la que los números en subíndice indican el porcentaje de conservación del nucleótido respectivo, cuya variante funcional es capaz de hibridar en condiciones rigurosas con el primer intrón como se representa en la SEC ID Nº: 5, en la que dichas condiciones de hibridación son hibridación en SCC 4 x a 65 ºC, seguido de una etapa de lavado en SCC 0, 1 x a 65 ºC durante una hora en un procedimiento para

(i) aumentar la expresión de un ácido nucleico de interés fusionado con el mismo;

(ii) modificar las características de crecimiento de una planta;

(iii) aumentar la producción de una planta;

(iv) aumentar la tolerancia a tensión de una planta;

(v) alterar la arquitectura de una planta;

(vi) modificar la composición de semillas de una planta; o

(vii) aumentar el contenido proteico de las semillas vegetales.

a condición de no haya combinación de la 5’UTR como se representa en SEC ID Nº 2 del gen GOS2 del arroz con el promotor del gen GOS2 del arroz.