ACIDOS NUCLEICOS REGULADORES TRANSCRIPCIONALES, POLIPEPTIDOS Y METODOS DE USO DE LOS MISMOS.

Un ácido nucleico aislado que codifica una proteína que tiene actividad CHD (modificadora de la organización de la cromatina-helicasa-de unión a ADN),

y que comprende:

(a) una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2;

(b) una secuencia de polinucleótidos que tiene como se muestra en el SEQ ID NO: 1; o

(c) una secuencia de polinucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 90% con el SEQ ID NO: 1, donde el % de identidad de la secuencia se basa en la secuencia completa del SEQ ID NO: 1 y se determina mediante análisis GAP 10 utilizando los parámetros por defecto

Tipo: Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: W0146326US.

Solicitante: PIONEER HI-BRED INTERNATIONAL, INC.
E.I. DU PONT DE NEMOURS AND CO
.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 800 CAPITAL SQUARE, 400 LOCUST STREET,DES MOINES, IOWA 50309.

Inventor/es: GORDON-KAMM, WILLIAM J., RAFALSKI, JAN ANTONI, SAKAI,HAJIME, TAO,YUMIN, SHEN,BO, LOWE,KEITH,S, DANILEVSKAYA,OLGA,N, MAHAJAN,PRAMOD,B, KLEIN,THEODORE,M.

Fecha de Publicación: .

Fecha Concesión Europea: 16 de Septiembre de 2009.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K14/415 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de vegetales.
  • C12N15/82A
  • C12N15/82A8
  • C12N15/82C8
  • C12N15/82C8D

Clasificación PCT:

  • A01H5/00 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A01 AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA.A01H NOVEDADES VEGETALES O PROCEDIMIENTOS PARA SU OBTENCION; REPRODUCCION DE PLANTAS POR TECNICAS DE CULTIVO DE TEJIDOS.Angiospermas,es decir, plantas con flores, caracterizadas por sus partes vegetales; Angiospermas caracterizadas de forma distinta que por su taxonomía botánica.
  • C07K14/47 C07K 14/00 […] › de mamíferos.
  • C12N15/29 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Genes que codifican proteínas vegetales, p. ej. taumatina.
  • C12N15/82 C12N 15/00 […] › para células vegetales.
  • C12N5/10 C12N […] › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus.

Clasificación antigua:

  • A01H5/00 A01H […] › Angiospermas,es decir, plantas con flores, caracterizadas por sus partes vegetales; Angiospermas caracterizadas de forma distinta que por su taxonomía botánica.
  • C07K14/47 C07K 14/00 […] › de mamíferos.
  • C12N15/29 C12N 15/00 […] › Genes que codifican proteínas vegetales, p. ej. taumatina.
  • C12N15/82 C12N 15/00 […] › para células vegetales.
  • C12N5/10 C12N 5/00 […] › Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus.

Fragmento de la descripción:

Ácidos nucleicos reguladores transcripcionales, polipéptidos y métodos de uso de los mismos.

Campo técnico

La presente invención se refiere en general a la biología molecular de las plantas. Más específicamente, se refiere a ácidos nucleicos y métodos para modular su expresión en plantas.

Antecedentes de la invención

Los principales avances en la transformación vegetal han tenido lugar a lo largo de los últimos años. No obstante, en las principales plantas de cultivo, tales como el maíz y la soja, todavía existen serias limitaciones en el genotipo. La transformación de líneas de cría de maíz agronómicamente importantes continúa siendo difícil y requiere mucho tiempo. Tradicionalmente, el único modo de lograr una respuesta en el cultivo ha sido mediante la optimización de los componentes del medio y/o el material y la fuente del explante. Esto ha conducido al éxito en algunos genotipos, pero la mayoría de los híbridos selectos no logran producir una respuesta en el cultivo favorable. Si bien la transformación de genotipos modelo es eficaz, el proceso de introgresión de transgenes en las endogamias de producción es laborioso, costoso y requiere mucho tiempo. Se ahorraría considerable tiempo y dinero si los genes pudieran ser introducidos y evaluados directamente en líneas endogámicas de producción o en híbridos comerciales.

Los métodos actuales para el diseño genético en el maíz requieren un tipo de célula específica como receptora del ADN foráneo. Estas células se encuentran en células de callo relativamente indiferenciadas, que crecen rápidamente o en la superficie escutelar del embrión inmaduro (que da lugar al callo). Con independencia del método de liberación utilizado actualmente, el ADN es introducido literalmente en miles de células, todavía se recuperan transformantes a frecuencias de 10-5 con respecto a las células que se expresan transitoriamente. Agravando este problema, el trauma que acompaña a la introducción del ADN dirige a las células receptoras a la detención del ciclo celular y la evidencia acumulada sugiere que muchas de estas células son dirigidas a apoptosis o muerte celular programada. (Referencia Bowen et al., Third International Congress of the International Society for Plant Molecular Biology, 1991, Resumen 1093). Por lo tanto sería deseable proporcionar métodos mejorados capaces de incrementar la eficacia de transformación en numerosos tipos celulares.

Típicamente se utiliza un marcador seleccionable para recuperar las células transformadas. Los esquemas de selección tradicionales exponen todas las células a un agente fitotóxico y se basan en la introducción de un gen de resistencia para recuperar los transformantes. Desafortunadamente, la presencia de células moribundas puede reducir la eficacia de la transformación estable. Por lo tanto sería útil proporcionar un sistema de selección positiva para recuperar los transformantes.

A pesar de los incrementos en el rendimiento y el área cosechada en todo el mundo, se prevé que en los próximos diez años, satisfacer la demanda de maíz requerirá un incremento del 20% adicional sobre la producción actual (Dowswell, C.R., Paliwal, R.L., Cantrell, R.P., 1996, Maize in the Third World, Westview Press, Boulder, CO).

En los cultivos híbridos, incluyendo cereales, semillas oleosas, forrajes, frutas y hortalizas, existen problemas asociados con el desarrollo y la producción de semillas híbridas. El proceso de polinización cruzada de plantas es laborioso y costoso. En el proceso de polinización cruzada, se debe evitar que la planta femenina sea fertilizada por su propio polen. Se han desarrollado muchos métodos a lo largo de los años, tales como el despenachado en el caso del maíz, y desarrollo y mantenimiento de líneas masculinas estériles, y el desarrollo de plantas que son incompatibles con su propio polen, por nombrar unos pocos. Puesto que los híbridos no se reproducen en realidad, el proceso debe ser repetido para la producción de cada lote de semillas híbridas.

Para complicar adicionalmente el proceso, las líneas endogámicas se cruzan. Por ejemplo en el caso del maíz, las líneas puras pueden tener un bajo rendimiento. Esto ofrece un serio desafío en la producción de maíz de semilla híbrida. De hecho, ciertos híbridos no pueden ser comercializados en absoluto debido al comportamiento de las líneas puras. La producción de semillas híbridas es por consiguiente costosa, lleva mucho tiempo y proporciona riesgos conocidos y desconocidos. Por lo tanto sería valioso desarrollar nuevos métodos que contribuyan al incremento de la eficacia de producción de la semilla híbrida.

A medida que se añaden nuevos rasgos a los cultivos comerciales por medio de ingeniería genética, surgen problemas con la "acumulación" de rasgos. Con el fin de desarrollar rasgos acumulados heredables, los rasgos deben estar ligados debido a las poblaciones segregantes. Los métodos mejorados de desarrollo de semillas híbridas que no requerirían el ligamiento de los rasgos acortarían significativamente el tiempo de desarrollo de semillas híbridas comerciales.

El silenciamiento génico es otro problema en el desarrollo de rasgos heredables con ingeniería genética. Frecuentemente se observa silenciamiento génico después de las divisiones meióticas. La eliminación o la reducción de este problema adelantarían el estado de la ciencia y la industria en esta área.

Compendio de la invención

Descripción detallada de la invención

Definiciones

El término "aislado" hace referencia a material, tal como un ácido nucleico o una proteína, que está: (1) sustancialmente o esencialmente libre de los componentes que normalmente acompañan o interaccionan con el material encontrado en su entorno natural o (2) si el material está en su entorno natural, el material ha sido alterado por la intervención humana deliberada hacia una composición y/o situado en un locus en la célula distinto del locus nativo del material.

Según se utiliza en la presente memoria, "ácido nucleico" representa un polinucleótido e incluye un polímero de cadena sencilla o doble de bases desoxirribonucleotídicas o ribonucleotídicas. Los ácidos nucleicos también pueden incluir fragmentos y nucleótidos modificados.

Según se utiliza en la presente memoria, "polinucleótido CHD" representa una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido CHD.

Según se utiliza en la presente memoria, "polipéptido" representa proteínas, fragmentos de proteínas, proteínas modificadas, secuencias de aminoácidos y secuencias de aminoácidos sintéticas. El polipéptido puede estar glicosilado o no.

Según se utiliza en la presente memoria, "polipéptido CHD" representa un polipéptido que contiene 3 dominios, un modificador de la organización de la cromatina, un dominio relacionado con la helicasa SNF-2/ATP, y un dominio de unión a ADN.

Según se utiliza en la presente memoria, "planta" incluye plantas y partes de plantas incluyendo pero no limitada a células vegetales, tejidos vegetales tales como hojas, tallos, raíces, flores, y semillas.

Según se utiliza en la presente memoria, "promotor" incluye la referencia a una región de ADN aguas arriba del inicio de la transcripción e implicada en el reconocimiento y unión de la ARN polimerasa y otras proteínas para iniciar la transcripción.

"Fragmento" quiere decir una porción de la secuencia de nucleótidos o una porción de la secuencia de aminoácidos y por consiguiente la proteína codificada de ese modo. Los fragmentos de una secuencia de nucleótidos pueden codificar fragmentos de proteína que conservan la actividad biológica del ácido nucleico nativo. Alternativamente, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos que son útiles como sondas de hibridación pueden no codificar fragmentos de proteína que conservan su actividad biológica. De este modo, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos son generalmente mayores de 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, o 700 nucleótidos y hasta e incluyendo la secuencia de nucleótidos completa que codifica las proteínas de la invención. Generalmente las sondas tienen menos de 1.000 nucleótidos y preferiblemente menos de 500 nucleótidos. Los fragmentos de la invención incluyen secuencias antisentido utilizadas para disminuir la expresión de los polinucleótidos de la invención. Tales fragmentos antisentido pueden tener una longitud variable que oscila entre 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, o 700 nucleótidos y hasta e incluyendo...

 


Reivindicaciones:

1. Un ácido nucleico aislado que codifica una proteína que tiene actividad CHD (modificadora de la organización de la cromatina-helicasa-de unión a ADN), y que comprende:

    (a) una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2;
    (b) una secuencia de polinucleótidos que tiene como se muestra en el SEQ ID NO: 1; o
    (c) una secuencia de polinucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 90% con el SEQ ID NO: 1, donde el % de identidad de la secuencia se basa en la secuencia completa del SEQ ID NO: 1 y se determina mediante análisis GAP 10 utilizando los parámetros por defecto.

2. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, donde el polinucleótido es de una monocotiledónea o una dicotiledónea.

3. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1 donde dicho porcentaje de identidad de la secuencia es de al menos 95%.

4. Un vector que comprende al menos un ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

5. Una casete de expresión que comprende al menos un ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 conectado operablemente a un promotor, donde el ácido nucleico está en orientación efectora.

6. Una célula anfitriona que contiene al menos una casete de expresión, vector o ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

7. La célula anfitriona de la reivindicación 3 que es una célula vegetal.

8. Una planta transgénica que comprende al menos una casete de expresión de la reivindicación 5.

9. La planta transgénica de la reivindicación 8, donde la planta es maíz, soja, sorgo, trigo, arroz, alfalfa, girasol, canola, algodón, o agrostis.

10. Una semilla de la planta transgénica de la reivindicación 8 o 9 que comprende dicha casete de expresión de la reivindicación 5.

11. Una proteína aislada que tiene actividad CHD (modificadora de la cromatina-helicasa-unión a ADN) y que comprende:

    (a) un polipéptido que tiene la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 2;
    (b) una secuencia polipeptídica que tiene una identidad de secuencia de al menos 90% con el SEQ ID NO: 2, donde el % de identidad de la secuencia se basa en la secuencia completa del SEQ ID NO: 2 y se determina mediante análisis GAP 10 utilizando parámetros por defecto; o
    (c) un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la reivindicación 1.

12. Una proteína de la reivindicación 11 donde dicho porcentaje de identidad es de al menos 95%.

13. Una ribosecuencia de ácido nucleico aislada que codifica una proteína de la reivindicación 11.

14. Un método para modular la actividad CHD (modificadora de la cromatina-helicasa-unión a ADN) en una célula anfitriona, que comprende:

    (a) transformar una célula anfitriona con al menos una casete de expresión de la reivindicación 5; y
    (b) hacer crecer la célula anfitriona transformada.

15. Un método para modular transitoriamente el nivel de actividad CHD (modificadora de la cromatina-helicasa-unión a ADN) en células anfitrionas que comprende introducir al menos un ácido nucleico de CHD de la reivindicación 1 para producir una célula transformada y hacer crecer la célula anfitriona transformada.

16. El uso de un constructo silenciador de CHD (modificador de la cromatina-helicasa-unión a ADN) como constructo de expresión cuyo ARNm transcrito o proteína actúa disminuyendo la expresión funcional de CHD activa, o de un anticuerpo dirigido contra un dominio funcional crítico en una molécula de CHD para reducir la actividad de la proteína CHD endógena en una planta o célula vegetal; donde la CHD cuya expresión o actividad es reducida o disminuida es una CHD como se define en la reivindicación 11 o 12.

17. El uso de acuerdo con la reivindicación 16 donde dicha disminución se logra por medio de la expresión de un constructo antisentido dirigido contra el gen estructural de CHD; por medio de un vector en el que el gen estructural de CHD o una de sus porciones se utiliza para elaborar una horquilla de silenciamiento; o donde la casete de expresión al alza de CHD que comprende un ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 se utiliza para co-suprimir los niveles de CHD endógena.

18. El uso de acuerdo con la reivindicación 16 o 17 para modular, opcionalmente transitoriamente, la actividad de CHD en una célula vegetal anfitriona.

19. El uso de acuerdo con la reivindicación 16 o 17 para potenciar la respuesta del cultivo de tejidos.

20. El uso de acuerdo con la reivindicación 16 o 17 para inducir la embriogénesis somática.

21. El uso de acuerdo con la reivindicación 16 o 17 para la selección positiva de una célula vegetal transformada.

22. El uso de acuerdo con la reivindicación 21, que comprende introducir un constructo silenciador de CHD como se define en la reivindicación 16 o 17 en dicha célula, donde dicho constructo silenciador de CHD comprende un promotor capaz de conducir la expresión en una célula vegetal, para producir una célula transformada, hacer crecer la célula transformada para producir un embrión transformado, y seleccionar el embrión transformado.

23. El uso de acuerdo con la reivindicación 21 o 22 que comprende adicionalmente introducir un gen de interés en la célula transformada.

24. El uso de acuerdo con la reivindicación 21, 22 o 23 que comprende adicionalmente alterar los componentes del medio para favorecer el crecimiento de las células transformadas.

25. El uso de acuerdo con la reivindicación 24 donde los componentes del medio se alteran para reducir la embriogénesis somática en células o transformadas.

26. El uso de acuerdo con la reivindicación 22, 23, 24 o 25 donde dicho constructo silenciador de CHD es escindido.

27. El uso de acuerdo con la reivindicación 26 donde dicho polinucleótido está flanqueado por secuencias FRT para permitir la escisión mediada por FLP del polinucleótido.

28. El uso de acuerdo con la reivindicación 16 o 17 para inducir la apomixis en una célula vegetal.

29. El uso de acuerdo con la reivindicación 28, que comprende introducir en una célula vegetal sensible un constructo silenciador de CHD como se define en la reivindicación 16 o 17 donde dicho constructo comprende opcionalmente un promotor inducible, para producir una célula vegetal transformada y hacer crecer la célula vegetal transformada para producir un embrión somático transformado.

30. El uso de acuerdo con la reivindicación 28 o 29 que comprende adicionalmente suprimir la expresión de un polinucleótido Polycomb FIE en la célula vegetal utilizando métodos efectores o antisentido.

31. El uso de acuerdo con la reivindicación 28, 29 o 30 que comprende adicionalmente hacer crecer el embrión para producir una planta regenerada.

32. El uso de acuerdo con la reivindicación 29, 30 o 31 donde dicho constructo silenciador de CHD es expresado en el integumento o en tejido de nucelo.

33. El uso de acuerdo con la reivindicación 16 o 17 para incrementar la eficacia de transformación, que comprende introducir un constructo silenciador de CHD y un gen de interés en una célula anfitriona sensible.

34. El uso de acuerdo con la reivindicación 16 o 17 para incrementar la recuperación de plantas regeneradas, que comprende introducir un constructo silenciador de CHD como se define en la reivindicación 16 o 17 en una célula anfitriona sensible y hacer crecer dicha célula para producir una planta regenerada.

35. El uso de acuerdo con la reivindicación 16 o 17 para disminuir el silenciamiento génico que comprende transformar establemente un constructo silenciador de CHD como se define en la reivindicación 16 o 17 y un gen de interés en una célula anfitriona y hacer crecer la célula anfitriona transformada.

36. El uso de acuerdo con la reivindicación 16 o 17 para incrementar la producción de aceite en una célula anfitriona, que comprende transformar establemente una célula anfitriona con un constructo silenciador de CHD como se define en la reivindicación 16 o 17 y hacer crecer la célula transformada para producir niveles elevados de aceite en comparación con una célula no transformada correspondiente.

37. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 36 donde dicha célula vegetal es de una monocotiledónea o una dicotiledónea.

38. El uso de acuerdo con la reivindicación 37 donde dicha monocotiledónea o dicotiledónea es maíz, soja, sorgo, trigo, arroz, alfalfa, girasol, canola, algodón, o agrostis.

39. Una planta en la cual la expresión funcional de CHD (modificador de la cromatina-helicasa-unión a ADN) disminuye por medio de un constructo silenciador de CHD, o en el cual un anticuerpo dirigido contra un dominio funcional crítico de CHD reduce la actividad de la proteína CHD endógena; donde la CHD cuya expresión o actividad es reducida o disminuida es una CHD como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 11 o 12.

40. Una planta de acuerdo con la reivindicación 39 donde dicha disminución o reducción se logra de una manera definida en la reivindicación 17.

41. Una planta de acuerdo con la reivindicación 39 o 40 que es una monocotiledónea o dicotiledónea.

42. Una planta de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 40 a 42 donde dicha monocotiledónea o dicotiledónea es maíz, soja, sorgo, trigo, arroz, alfalfa, girasol, canola, algodón, o agrostis.


 

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