Plantas que sobreexpresan una proteína de tipo NAP1 con aumento del rendimiento de semillas, método para producir las mismas.

Método para aumentar el rendimiento de semillas de una planta con relación a plantas de tipo naturalcorrespondientes,

que comprende aumentar la expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica para unaproteína de tipo NAP1 en una planta introduciendo dicha secuencia de ácido nucleico en una planta mediantetransformación, en el que dicha secuencia de ácido nucleico que codifica para dicha proteína de tipo NAP1 seselecciona del grupo que consiste en:

(i) un ácido nucleico representado por SEQ ID NO: 1;

(ii) un ácido nucleico que codifica para una proteína de tipo NAP1 representada por SEQ ID NO: 2, y

(iii) un ácido nucleico que codifica para una proteína que es un homólogo para la proteína representada en SEQ IDNO: 2; en el que dicha proteína que es un homólogo tiene una identidad de secuencia de al menos el 50% con laproteína representada por SEQ ID NO: 2,

(iv) una variante alternativa de corte y empalme de una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteínade tipo NAP1 definida en (i), (ii) o (iii);

(v) una variante alélica de una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína de tipo NAP1 definida en(i), (ii) o (iii); y

(vi) una secuencia de ácido nucleico que puede hibridarse con un ácido nucleico que codifica para un polipéptidomostrado en SEQ ID NO: 2 en condiciones rigurosas;

en el que la proteína de tipo NAP1 comprende un dominio NAP, comprendiendo dicho dominio NAP una secuenciadistintiva (T/S) FF (T/N/S/E/D) (W/F) (L/F) y/o la secuencia de aminoácidos conservada facilitada en SEQ ID NO: 33;

y

en el que la proteína de tipo NAP1 comprende un extremo C-terminal ácido, siendo dicho extremo C-terminal ácidoel extremo carboxi-terminal de dicha proteína que tiene de 20 a 25 aminoácidos de largo, del que al menos 13residuos son ácido glutámico y/o aspártico; y

en el que la proteína de tipo NAP1 tiene actividad de inhibición de la fosfatasa PP2a.

Plantas que sobreexpresan una proteína de tipo NAP1 con aumento del rendimiento de semillas, método para producir las mismas.

La presente invención se refiere a un método para mejorar características de crecimiento, y en particular para aumentar el rendimiento de una planta. Más específicamente, la presente invención se refiere a un método para aumentar el rendimiento modulando la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica para una proteína homóloga a la proteína de ensamblaje de nucleosomas 1 (proteína de tipo NAP1) . La presente invención también se refiere a plantas que tienen modulada la expresión de un ácido nucleico que codifica para una proteína de tipo NAP1, plantas que tienen un aumento del rendimiento con relación a plantas de tipo natural correspondientes.

Dada la población mundial cada vez mayor, y la disminución del área de tierra disponible para la agricultura, sigue siendo un objetivo principal mejorar la eficacia de la agricultura y aumentar la diversidad de plantas en horticultura. Los medios convencionales para las mejoras de cultivos y en horticultura utilizan técnicas de reproducción selectiva para identificar plantas que tienen características deseables. Sin embargo, tales técnicas de reproducción selectivas tienen varios inconvenientes, concretamente que estas técnicas requieren normalmente mucha mano de obra y dan como resultado plantas que contienen a menudo complementos genéticos heterogéneos que pueden no dar siempre como resultado el rasgo deseable que se transmite desde las plantas parentales. Los avances en la biología molecular han permitido a la humanidad manipular el germoplasma de animales y plantas. La ingeniería genética de plantas conlleva el aislamiento y la manipulación de material genético (normalmente en forma de ADN o ARN) y la posterior introducción de ese material genético en una planta. Tal tecnología ha conducido al desarrollo de plantas que tienen diversos rasgos económicos, agronómicos u hortícolas mejorados. Rasgos de particular interés económico son características de crecimiento tales como alto rendimiento.

Las proteínas NAP forman una familia de proteínas relacionadas que se conocen en animales y se notifica que están implicadas en actividades relacionadas con la cromatina. La familia de proteínas NAP se caracteriza por la presencia de una secuencia conservada conocida como dominio NAP. El dominio NAP se describe en las bases de datos Pfam (registro PF00956) e Interpro (registro IPR002164) . NAP es un componente de un complejo multifactorial que media el empaquetamiento de ADN en nucleosomas (Krude, T. y Keller, C. (2001) Cell. Mol. Life Sci. 58, 665-672) . Durante la fase S del ciclo de división celular en eucariotas, el ADN recién replicado se ensambla rápidamente en la cromatina. Este proceso requiere la acción coordinada de varios factores. En las etapas iniciales, CAF1 (factor 1 de ensamblaje de cromatina) se une a las proteínas histonas H3 y H4 y las dirige a la horquilla de replicación a través de la unión a PCNA. La deposición posterior de las proteínas histonas H2A y H2B está mediada por proteínas NAP1. NAP1 se describió por primera vez en células HeLA (von Lindern et al. (1992) Mol. Cell. Biol. 12, 3346-3355) y se encontró más tarde conservada en todas las eucariotas. Además, se cree que las proteínas NAP regulan la transcripción génica y pueden influir en el desarrollo y la diferenciación celulares.

Las proteínas SET están sumamente relacionadas con las proteínas NAP y desempeñan un papel en diversos procesos celulares en seres humanos. En células humanas, se ha mostrado que las SET están asociadas con diversos complejos de CDK-ciclina durante la regulación del ciclo celular, tal como la transición G2/M. SET es un potente inhibidor de la proteína fosfatasa 2A (PP2A) que está implicada en varias rutas de señalización. La actividad inhibidora de SET podría atribuirse a un dominio C-terminal ácido (Canela et al. (2003) J. Biol. Chem. 278, 11581164) . Otros informes muestran la implicación de SET en la transcripción y la reparación de ADN. SET es parte de un complejo que tiene actividades de unión y curvatura del ADN mediadas por la proteína asociada a la cromatina HMG2. HMG2 facilita el ensamblaje de estructuras de orden superior de nucleoproteínas mediante la curvatura y formación de bucles de ADN o mediante la estabilización de ADN subenrollado. HMG2 precipita conjuntamente con SET (Fan et al. (2002) Mol. Cell. Biol. 22, 2810-2820) . También se notifica que SET inhibe la desmetilación activa de ADN (Cervoni et al. (2002) J. Biol. Chem. 277, 25026-25031) . La oncoproteína Set/TAF-1, implicada en la inhibición de la acetilación de histonas, también inhibe la desmetilación de ADN metilado de manera ectópica que da como resultado el silenciamiento génico. Se sugiere que Set/TAF-I desempeña un papel en la integración de estados epigenéticos de histonas y ADN en la regulación génica.

La actividad de las proteínas NAP1 está regulada en parte mediante fosforilación. Se mostró que la localización subcelular de NAP1 en Drosophila depende de su estado de fosforilación, que puede controlarse por caseína cinasa II (Rodriguez et al (2000) J. Mol. Biol. 298, 225-238) . Se notifica que los mamíferos presentan varias proteínas NAP1, mientras que en levaduras sólo existe una proteína NAP1 conocida.

Los ortólogos de NAP1 de plantas siguen siendo desconocidos en gran medida, aunque se notificaron proteínas NAP1 de la soja (Yoon et al (1995) Mol. Gen. Genet. 249, 465-473) , Arabidopsis, tabaco, maíz y arroz (Dong et al. (2003) Plant 216, 561-570) . El análisis filogenético de genes de tipo NAP1 de plantas ha revelado que existen dos subgrupos, uno relacionado con NAP1 y el otro con la proteína SET (figura 1) . De la manera más probable, puede haberse producido divergencia de secuencia posterior puesto que el agrupamiento de las dos secuencias de Arabidopsis, las dos de maíz y las dos de tabaco señalan en conjunto a un efecto de duplicación génica más reciente. El genoma de Saccharomyces cerevisiae contiene sólo un gen que codifica para NAP, que combina las propiedades funcionales de ambos subgrupos de NAP1 y SET. De manera similar, el factor 1 de activación de molde (TAF-1) , un homólogo de NAP1, combina tanto actividad de inhibición de PP2a (Saito et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 259, 471-475, 1999) como actividad de remodelación de cromatina (Kawase et al., Genes Cells 1, 10451056, 1996) . Por tanto, es probable que las proteínas de plantas de la familia NAP/SET sean redundantes en gran medida en su función, particularmente en el grupo de proteínas SET en el que se observa un menor grado de divergencia en comparación con el grupo de NAP. Además, existen pruebas estructurales de que las proteínas NAP y SET pertenecen a la misma familia puesto que comparten el dominio NAP que va seguido por una región ácida Cterminal.

Se conoce poco sobre la función de proteínas de tipo NAP1 en plantas, aunque se ha propuesto un papel en la mitosis y la citocinesis (Dong et al 2003) . De la manera más probable, los ortólogos de plantas de la proteína NAP1 desempeñan un papel diferente que sus homólogos de animales. Basándose en su localización nuclear y en las similitudes de secuencia con la proteína SET de mamífero, puede esperarse un papel en la remodelación de cromatina para las proteínas de plantas. Además, el grupo de proteínas NAP/SET de plantas podría estar implicado en la regulación de PP2A en plantas. PP2A es una de las principales fosfatasas en plantas, que actúa en gran medida sobre factores de transcripción y proteínas cinasas, y se ha propuesto que regula la actividad de proteínas implicadas en una variedad de procesos celulares, incluyendo el ciclo celular (Ayaydin et al. (2000) Plant J. 23, 8596) , acciones hormonales tales como el movimiento de estomas mediado por ABA, la germinación (Kwak et al. (2002) Plant Cell 14, 2849-2861) , o el transporte de auxina y el desarrollo de las raíces (Garbers et al 1996 EMBO J. 15, 2115-2124) . Se notifica además que PP2A está implicada en la fotosíntesis y la señalización luminosa (Sheen (1993) EMBO J. 12, 3497, 3505) y en la asimilación de nitrógeno (Hirose y Yamaya (1999) Plant Physiology 121, 805-812) .

Hasta la fecha, no se han descrito efectos sobre rasgos agronómicos con la modulación de la expresión de proteínas de tipo NAP1 en plantas. Se ha descubierto ahora sorprendentemente que la modulación de la expresión de un ácido nucleico que codifica para una proteína de tipo NAP1 en una planta proporciona que las plantas tengan un crecimiento y desarrollo mejorados, en particular el aumento del rendimiento, más particularmente el aumento del rendimiento de semillas en comparación... [Seguir leyendo]

1. Método para aumentar el rendimiento de semillas de una planta con relación a plantas de tipo natural correspondientes, que comprende aumentar la expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína de tipo NAP1 en una planta introduciendo dicha secuencia de ácido nucleico en una planta mediante transformación, en el que dicha secuencia de ácido nucleico que codifica para dicha proteína de tipo NAP1 se selecciona del grupo que consiste en:

(i) un ácido nucleico representado por SEQ ID NO: 1;

(ii) un ácido nucleico que codifica para una proteína de tipo NAP1 representada por SEQ ID NO: 2, y

(iii) un ácido nucleico que codifica para una proteína que es un homólogo para la proteína representada en SEQ ID NO: 2; en el que dicha proteína que es un homólogo tiene una identidad de secuencia de al menos el 50% con la proteína representada por SEQ ID NO: 2,

(iv) una variante alternativa de corte y empalme de una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína de tipo NAP1 definida en (i) , (ii) o (iii) ;

(v) una variante alélica de una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína de tipo NAP1 definida en (i) , (ii) o (iii) ; y

(vi) una secuencia de ácido nucleico que puede hibridarse con un ácido nucleico que codifica para un polipéptido mostrado en SEQ ID NO: 2 en condiciones rigurosas;

en el que la proteína de tipo NAP1 comprende un dominio NAP, comprendiendo dicho dominio NAP una secuencia distintiva (T/S) FF (T/N/S/E/D) (W/F) (L/F) y/o la secuencia de aminoácidos conservada facilitada en SEQ ID NO: 33; y

en el que la proteína de tipo NAP1 comprende un extremo C-terminal ácido, siendo dicho extremo C-terminal ácido el extremo carboxi-terminal de dicha proteína que tiene de 20 a 25 aminoácidos de largo, del que al menos 13 residuos son ácido glutámico y/o aspártico; y

en el que la proteína de tipo NAP1 tiene actividad de inhibición de la fosfatasa PP2a.

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicho ácido nucleico se deriva de una planta, preferiblemente de una planta dicotiledónea, más preferiblemente de la familia Brassicaceae, lo más preferiblemente de Arabidopsis thaliana.

3. Método según las reivindicaciones 1 y 2, en el que dicho aumento del rendimiento de semillas comprende uno o más de aumento del número de semillas llenas, aumento del peso total de semillas o aumento del índice de cosecha, cada uno con relación a plantas de tipo natural correspondientes.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho ácido nucleico que codifica para una proteína de tipo NAP1 está unido operativamente a un promotor constitutivo, preferiblemente un promotor GOS2.

5. Uso de una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína de tipo NAP1 según la reivindicación 1, para aumentar el rendimiento de semillas de una planta, en el que se aumenta el rendimiento de semillas de la planta aumentando la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico, en el que la expresión de dicho ácido nucleico se aumenta introduciendo dicha secuencia de ácido nucleico en la planta mediante transformación.

6. Uso de una proteína de tipo NAP1 codificada por un ácido nucleico según la reivindicación 1, para aumentar el rendimiento de semillas de una planta, en el que se aumenta el rendimiento de semillas de la planta aumentando el nivel de dicha proteína de tipo NAP1, en el que se aumenta el nivel de dicha proteína de tipo NAP1 introduciendo el ácido nucleico que codifica para dicha proteína de tipo NAP1 en la planta mediante transformación.

7. Uso según la reivindicación 5 ó 6, en el que dicho aumento del rendimiento de semillas comprende uno o más del peso total de semillas, el número de semillas llenas y el índice de cosecha.

8. Uso de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que la secuencia de dicho ácido nucleico que codifica para una proteína de tipo NAP1 o de la propia proteína de tipo NAP1 es tal como se representa en SEQ ID NO: 1 ó 2.